【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 將PPV抗原加入酶標(biāo)板孔內(nèi)，每孔100ul，37℃作用1h后置4℃冰箱過(guò)夜：棄去孔內(nèi)液體，用洗滌夜洗3次，每次3分鐘，用吸水紙拍干：各孔加入封閉液100ul。37℃：待檢血清經(jīng)56℃ 30分鐘滅活后用洗滌液稀，每孔加入100ul，37 ：用洗滌液將酶標(biāo)抗體按工作濃度稀釋?zhuān)靠?00ul，37 1h，（OPDH2O2）：每孔100ul室溫避光顯色25分鐘：每孔加50ul終止液反應(yīng)終止反應(yīng) ：在上酶聯(lián)檢測(cè)儀490nm波長(zhǎng)處讀數(shù)，按1∶20稀釋后作間接ELESA實(shí)驗(yàn)，測(cè)定490nm波長(zhǎng)處OD值，規(guī)定以60 份血清的平均OD值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為判定陰陽(yáng)性的臨界值IFA將分離毒第5代毒接種于Marc145，培養(yǎng)，培養(yǎng)48h，冷丙酮固定10min，分別加入1∶20的PRRSV\HCV、PPV\PRV高免血清，PRRSV陰性血清，37℃1h， PBS洗滌3次，再加入1∶40瑩光標(biāo)記兔抗豬IgG，37℃ 1h, ，甩干，熒光顯微鏡下觀察。設(shè)PRRSV美洲株和未接毒細(xì)胞對(duì)照病毒的粗提純濃縮（中性鹽沉淀法）（以偽狂犬病病毒為例）原理：病毒在45%以上飽和的硫酸銨溶液中沉淀，且保持其感染性。一．實(shí)驗(yàn)步驟：將病毒液反復(fù)凍融3次——，于4 ℃冰箱攪拌沉淀過(guò)夜——離心沉淀——棄上清——用適量的水或（PBS）懸浮——裝透析袋透析以除去硫酸銨再濃縮到原液的40倍。1．病毒材料：將偽狂犬病病毒接種于BHK21細(xì)胞，病變后收集細(xì)胞培養(yǎng)物，反復(fù)凍融3次，即為樣品材料。2．病毒提純濃縮先將細(xì)胞培養(yǎng)物3000rpm離心30min(4℃)，棄去細(xì)胞碎片及雜質(zhì)，收集上清夜，攪勻后置4℃冰箱攪拌沉淀過(guò)夜。然后5000rpm離心40min（4℃），去上清，沉淀用適量的滅菌ddH2O懸?。ㄈ缭w積的20%），裝與透析袋中，于ddH2O中攪拌透析，每半個(gè)小時(shí)換一次液，共換5次，第5次透析過(guò)夜，透析完成后，取出，用聚乙二醇或蔗糖將病毒濃縮至原體積的1/40，即得初步提純的病毒液。分子病毒實(shí)驗(yàn)技術(shù)一．PCR (一)PCR步驟：1） 變性 加熱至9095℃，氫鍵斷裂，雙鏈解離成單鏈。2） 復(fù)性 降溫至425562℃，使引物與其互補(bǔ)的摸板在局部形成雜交DNA雙鏈。3） 延伸 72℃，在DNA聚合酶、4種dNTP、Mg+2存在條件下，引物延長(zhǎng)，新鏈合成。（二）幾種PCR摸板的處理方法1）細(xì)菌：挑細(xì)菌于離心管中，加適量ddH2O，渦懸，于沸水浴中變性10min（電爐，飯盒，帶孔泡沫塊）速置冰浴中，12000rpm 離心數(shù)秒，取上清作模板。或取細(xì)菌培養(yǎng)液200ul，12000rpm 2min去上清，加80100ul水懸浮，于沸水浴中變性10min，迅速置冰浴中，12000rpm離心數(shù)秒，取上清作模板。2）細(xì)胞培養(yǎng)物：收集病變細(xì)胞（勿凍融）懸液，10000rpm離心數(shù)秒，取細(xì)胞沉淀用適量sample Buffer 懸浮( ulTEN或生理鹽水懸浮，后同病料處理)，加入蛋白酶K至終濃度為100ug/ml，37℃1h，取出于沸水浴中變性10min，迅速置冰浴中，3000rpm離心數(shù)秒，取上清作模板。 Sample Buffer 終濃度KCL 50mM TrisHCl() 10mM 明膠 %Triton x100 %NP40 %Tween 20 %3) 質(zhì)粒、病毒基因組DNA 沸水浴中變性10min，迅速置冰浴變性10min,迅速置冰浴中備用4） 料與鼻拭子（1） 勻漿器將病料組組織充分勻漿，用TEN緩沖液/生理鹽水按1:5稀釋?zhuān)?） 收集懸液于離心管內(nèi)，20℃凍融3次（3） 5000rpm5min（4） ，加入25ul的10%SDS（%，破外細(xì)胞組分）（終濃度為100ug/ml，消化去掉蛋白質(zhì)，尤其是與DNA給合的組蛋白），混勻。（5） 50℃水浴過(guò)液（6） 用等體積（500ul）的苯酚：異戊醇、苯酚：氯仿：異戊醇、氯仿：異戊醇名抽提一次（去掉蛋白質(zhì)和細(xì)胞膜組分）(7) 吸取上清，加倍量 無(wú)水乙醇、 NaAc于20℃沉淀30min，10000rpm 10min,（8） 沉淀用70%洗一次，真空干，用20ul ddH2O溶解，20℃保存?zhèn)溆米ⅲ嚎焖俸?jiǎn)便的方法：檢測(cè)樣品可為純化DNA，亦可為細(xì)胞、組織、任何含病毒的樣品。一般無(wú)須提取DAN,直接取少量樣品（少于10ul）,高溫低滲液體（如水煮沸變性10分鐘后）溶解細(xì)胞制備摸板進(jìn)行PCR。（三）病料中RNA提取1）取樣品（病料上清和雞胚液）125250200ul/樣，加入375750400ulRNA 提取裂解劑（TRIZO）(1∶3)—RNA ex Reagant Ls?；靹?，渦懸，靜置510min。2）加入氯仿100200200ul（5∶1），手搖顛倒混勻，渦懸靜置510min。12000r/min離心1012min。3）取上清（先調(diào)槍為100ul，共取得300600ul）,加入等兩量的冰凍的異丙醇（吸去取異丙醇時(shí)平移槍頭哦，以免槍頭滴液），震蕩，混勻，室溫510min 或20℃30min(梢長(zhǎng)無(wú)妨，如過(guò)夜)。置室溫溶解，4℃12000r/min 1012min,棄上清，吸干管口余液。4）加入適量冰凍75%乙醇或1ml 75% DEPC 水處理乙醇（750ml 無(wú)水乙醇+250DEPC水）洗滌，4℃750012000r/min 610min,棄上清。放置于平鋪的一張潔凈紙上，置超凈臺(tái)風(fēng)干（約1020min）.5）加入101520ul的nucleasefree water 即DEPC水/(15ulTE ) /樣品，于3856℃水浴溶解約10min。（最佳70℃保存）.抽吸混勻,進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)如RTPCR。Rnase:無(wú)處不在（如人是皮膚，故需作戴手套）及難于滅活（高壓滅菌和蛋白抑制劑不能使所有的RNA完全失活）。氯仿擦拭處理的用具，通?？上齊nase的活性。注意：PCR產(chǎn)物電泳中在目標(biāo)帶前可可能出現(xiàn)引物二聚體的帶，而提質(zhì)粒電泳在目標(biāo)帶前可能出現(xiàn)RNA帶。準(zhǔn)備物品：槍頭（200UL/1000UL）、槍?zhuān)?00UL/1000UL）、RNA抽提試劑、氯仿、異丙醇、75%乙醇（用無(wú)水乙醇配制如750ML無(wú)水乙醇+250DEPC水）等。PCR 模板的組成，欲擴(kuò)增片段的長(zhǎng)度及其不同的使用目的，對(duì)引物的要求是不一樣的；基因組DNA作模板時(shí)，由于其數(shù)量的膨大及結(jié)構(gòu)復(fù)雜，除特異擴(kuò)增外，易產(chǎn)生非特異擴(kuò)增產(chǎn)物?？傇瓌t：提高擴(kuò)增效力和特異性。（四）引物1．據(jù)DNA（DNAV）或CDNA（RNAV）的已發(fā)表的相關(guān)序列（病毒獨(dú)特的基因區(qū)域）來(lái)設(shè)計(jì)2．如為診斷用PCR，直接設(shè)計(jì)即可。3．如要酶切鑒定及克隆PCR產(chǎn)物，加入保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)5‘端（酶切位點(diǎn)的選擇要考慮序列內(nèi)部自身已有的酶切位點(diǎn)，以免多點(diǎn)切割基因）。4．如要將目的序列（PCR產(chǎn)物）進(jìn)行表達(dá)，加入保護(hù)堿基和酶切位點(diǎn)，起始子和終止子密碼，終止子TAA、TAG、TGA，起始子：ATG5．上游引物P1與序列5‘端序列相同（ATG），下游引物P2與序列3‘端互補(bǔ)且反向（TTA，CTA，TCA）。例：PRVEPO基因的克隆表達(dá)及序列分析PCR擴(kuò)增：據(jù)國(guó)外報(bào)道的INFH株EPO基因的核苷酸序列，設(shè)計(jì)一對(duì)能包括EPO基因完整編碼區(qū)的特異性引物，上、下游引物分別設(shè)計(jì)了ECOR I和Xba I酶切為點(diǎn)。上游引物P1：5’——TTTGAATTCACCATGGGCTGCACGGTC——3’ 保護(hù)堿基 EcoR I 起始子 與Epo基因的核苷酸序列相同下游引物P2：—TTTTCTGAGTCAGTCGTCGTCGTGGGTG——3’ 保護(hù)堿基 Xba I 終止子 與Epo基因的核苷酸序列互補(bǔ)且反向EPO序列：5’——ATG GGCACGGTC——CACCCAGGACGACGACTGA （互補(bǔ)且反向）——3’引物設(shè)計(jì)原則：1）長(zhǎng)度以1530nt為宜。增加長(zhǎng)度并提高退火溫度，或選擇其他DNA序列合成新的特異引物可提高特異性。2）擴(kuò)增片段在3001000bp為宜；RTPCR以500bp為宜；過(guò)短不易檢 測(cè)，過(guò)長(zhǎng)不易擴(kuò)增。優(yōu)化條件下，可擴(kuò)增大于10Kb的片段。3）引物堿基組成隨機(jī)分布，避免嘌呤或嘧啶堆聚現(xiàn)象。G+C含量在4550%左右為宜；4）引物間尤其3’端不應(yīng)有互補(bǔ)序列（4個(gè)堿基以上），以免形成二級(jí)結(jié)構(gòu)；5）引物序列必須是被檢病毒特異的，在待擴(kuò)增區(qū)域的兩邊均找出約20 個(gè)核苷酸（G+C）含量相近的合適序列。引物的堿基順序不與非擴(kuò)增區(qū)域有同源性，要求用計(jì)算機(jī)進(jìn)行補(bǔ)助檢索分析。6）原則上引物3’末端堿基與模版DNA一定要配對(duì)，3’末端堿基不選A（選T、C、G）。5’端可不與模版匹配。如PCR產(chǎn)物用于克隆，在5’端加上單一的酶切位點(diǎn)。可加錯(cuò)配堿基，造成突變。可加ATG其使密碼。最多可游離10個(gè)bp。7）退火溫度（1525bp）Tm=4（G+C）+2（（A+T），一般1Kb以?xún)?nèi)，延伸1min足夠，多于1Kb，則延長(zhǎng)時(shí)間，擴(kuò)增10Kb，延伸15min。不管模版濃度多少，2030次循環(huán)較合理。8）PCR產(chǎn)物bp相差不大，如26bp與71bp，可用較高濃度的瓊脂糖1820g/L電泳分離，效果較好。PCR反應(yīng)各組分濃度：1）MgCL2：Mg+過(guò)多則非特異擴(kuò)增，過(guò)少則擴(kuò)增效率較低?？深A(yù)實(shí)驗(yàn)確定最佳Mg+濃度，終濃度一般為14mmol/L，工作濃度一般為25mmol/L.（3ul）2）引物：（100500nmol/L），（500ng）工作濃度一般為0 umol/L（1ul）。一般將5個(gè)OD值（33ug/OD）用400ulddH2O溶解，計(jì)算出其濃度，一般用500ul溶解50uM，分裝保存。取其一做5倍稀釋?zhuān)ㄒ话銥?0uM）作為工作濃度近期保存使用。3）dNTP：終濃度一般為50200umol/L工作濃度一般為2mmol/L（1ul）、4）TaqE：，工作濃度一般為5U/uL（）5）變性劑：加入適量者如（二甲亞砜DMSO（50ul jia ）、5%甲酰胺、尿素等）可減少模版二級(jí)結(jié)構(gòu)提高特異性尤在RTPCR加入5%甲酰胺提高特異性且cDNA產(chǎn)量大增。5）PCR的條件優(yōu)化：通過(guò)改變退火溫度或Mg+濃度來(lái)獲得真實(shí)的擴(kuò)增結(jié)果對(duì)于復(fù)雜的 混合物，采用另一對(duì)嵌套引物可改善其特異性。循環(huán)參數(shù)：變性溫度9295 ，4060Sec， 退火溫度55 ，3050Sec， 延伸溫度72 ，6090Sec 循環(huán)次數(shù)2540 次注意：%（250：1）左右誤差，如克隆PCR片段，制備點(diǎn)突變或缺失突變株時(shí)，用具校對(duì)錯(cuò)誤堿基功能的VentDNA聚合酶，合成誤差比TaqE：小得多。合成的引物進(jìn)行PCR反應(yīng)時(shí)無(wú)目的帶？1）引物和模板是否配對(duì)，同源性有多大？2）引物本身是否有立體結(jié)構(gòu)，或兩條引物間是形成高次結(jié)構(gòu)？3）PCR試劑/PCR儀是否正常？重新合成引物一試核酸定量：1mg./mldsDNAA260=20； ssDNA\RNAA260=25DNA純度：如dsDNAA260/A280=；如，則RNE污染，如，則蛋白質(zhì)污染Ds DNA 10Kbp=106Dalton 1OD260nm=50ugSsDNA 10Kbp=106Dalton 1OD260nm=40ugRNA 10Kbp=106Dalton 1OD260nm=40ug1bp=660Dalton 1nt=330 Dalton蛋白質(zhì) BSA∶1OD260nm= （1mg/ml= OD260nm）氨基酸平均分子量 =110Dalton核酸蛋白質(zhì) 1Kb RNA=37k Dalton 蛋白 10 kDalton 蛋白=273Base RNADEPC 水；%的DEPC（焦碳酸二乙酯），室溫（37℃）處理過(guò)夜，然后高壓滅菌，去除DEPC。測(cè)序樣品提供：：說(shuō)明Vector名稱(chēng)及結(jié)構(gòu)情況，插入片段的長(zhǎng)度及插入片段的酶切位點(diǎn)情況，提供35ug提純的質(zhì)粒DNA （濃度大于200ng/ul）；說(shuō)明菌體的種類(lèi)及抗生素抗性的情況，所含載體的名稱(chēng)及結(jié)構(gòu)情況，插入片段的長(zhǎng)度及插入片段的酶切位點(diǎn)情況。；提供切膠回收純化的PCR產(chǎn)物13ug （濃度大于100ng/ul）并說(shuō)明PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度，引物的具體序列等情況。小于100bp 不能測(cè)序。雙脫氧末端終止法測(cè)序：（樣品模板DNA準(zhǔn)備）將待測(cè)病毒DNA 或cDNA（RNAV）重組到M13噬菌體或高拷貝質(zhì)粒（如PUC系列），獲得病毒核酸片段的克隆?；蛴肞CR大量擴(kuò)增待測(cè)片段。然后堿變性雙鏈DNA為單鏈DNA模板。按退火，延伸標(biāo)記反應(yīng)（加T7測(cè)序酶聚合酶，5分鐘），延伸終止（將延伸標(biāo)記等份4份，加入4種ddNTP，使反應(yīng)終止于所有可能發(fā)生的位置），終止反應(yīng)（95100℃），電泳分離，放射自顯影條帶，讀出序列。序列數(shù)據(jù)庫(kù)：兩個(gè)最大的DNA數(shù)據(jù)庫(kù)為歐洲的EMBL和美國(guó)的GenBank也建成了蛋白質(zhì)和RNA序列的數(shù)據(jù)庫(kù)序列分析：測(cè)序所得系列用計(jì)算機(jī)和軟件包來(lái)分析，如威勢(shì)康星大學(xué)的GCG軟件包，或PC程序如DNAstar，用Blast軟件對(duì)目的基因和參照基因進(jìn)行DNA核苷酸序列和編碼氨基酸序列進(jìn)行（同源性）分析。如兩基因比較，1有19處發(fā)生了點(diǎn)突變，兩者同