【文章內(nèi)容簡介】 前者無凝集而與后者有凝集，則表示傷寒桿菌免疫血清中的抗腸炎抗體已被完全吸收。 實驗四 溶血反應(yīng)和補體結(jié)合試驗 一．溶血反應(yīng) 免疫血清與其相應(yīng)的抗原細胞 (血球、細菌 及其組織細胞相遇，并在補體的參與下可出現(xiàn)溶細胞反應(yīng)。依抗原、抗體的種類不同可有溶血反應(yīng)、溶菌反應(yīng)等。 溶菌反應(yīng)只在某些細菌中出現(xiàn) (如霍亂弧菌 )。應(yīng)用溶血反應(yīng)是補體結(jié)合反應(yīng)中不可少的因素。溶血反應(yīng)是由于抗原 (紅血球 )和抗體 (溶血素 )進行特異性的結(jié)合，并吸著了補體，而使紅血球在補體的作用下被溶解，于是產(chǎn)生了溶血現(xiàn)象。 材料： 1. 抗原： 2%綿羊紅血球。 2. 抗體：溶血素 3. 補體：取健康豚鼠血清作為補體。 4. 小試管、生理鹽水、水浴箱。 方法： 1．取小試管 3 只，按下表加入各物 (容量單位為毫升 ) 試管 2%紅血球溶血素 (2 單位 )補體 (2 單位 )生理鹽水結(jié)果 —— —— 2．將上述 3 試管放在 37℃水浴箱內(nèi) 15— 30 分鐘觀察有無凝血現(xiàn)象。 二．補體結(jié)合反應(yīng) 當抗原與其對應(yīng)的抗體結(jié)合時，所生成的抗原抗體復(fù)合物能從溶液中將補體吸著此即謂補體結(jié)合。參與補體結(jié)合反應(yīng)的抗原是透明的溶液，故補體結(jié)合現(xiàn)象不能被肉眼看 出來，因此必須借助溶血系統(tǒng) (溶血素及相對應(yīng)的羊血球 )作為指示劑，來判定媒質(zhì)中有無游離的補體，近而推定媒質(zhì)中未知抗原 (或抗體 )和已知抗體 (或抗原 )是否進行了特異性的結(jié)合。本反應(yīng)具有很高的敏感性及特異性，因之常應(yīng)用于傳染病的診斷，特別診斷病毒疾病和梅毒。 由于參與本反應(yīng)的各種成分間有著一定量的關(guān)系，因此在作本試驗之前，必須通過一系列的預(yù)備實驗來確定各成分的使用量，故本反應(yīng)的實驗方法較為復(fù)雜。 本次實驗以傷寒桿菌免疫血清與其相對應(yīng)的抗原補體結(jié)合試驗為例。 材料： 1. 抗原：傷寒的抽出液 2. 抗體：傷寒桿菌的免疫血清 3. 補體：豚鼠血清 4. 溶血素：抗綿羊血細胞的兔血清 5. 2%綿羊紅血球 6. 小試管、試管架、水浴鍋。 方法： (一 )預(yù)備試驗 (示教說明 ) 預(yù)備試驗包括溶血素效價的滴定，補體效價的滴定，抗原效價的滴定及被檢血清的處理。 (1) 溶血素效價的滴定 按照下表加入各物 管號溶血素 (ml)溶血素 稀釋倍數(shù) 1： 20 補體 (ml)生理 鹽水 (ml)2%羊血球 (ml) 假定結(jié)果 ： 搖勻后置 37℃水浴一小時 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： 全溶解 ： ： ： 對照 凡最高稀釋度的溶血素可呈現(xiàn)完全溶血者為一個單位。依上表結(jié)果第10 管 (即 1： 4000 倍稀釋 ) 毫升溶血素為一個單位，在溶血反應(yīng)中常用 毫升中含有 2 個溶血素單位的溶液，所以試驗時應(yīng)取 1： 2020倍稀釋的溶液。 (2) 補體單位滴定 依下表加入各試劑： 管 號補體 (1： 20)(ml)抗原 (ml)生理鹽水 (ml)置 于 37 ℃ 水 浴 45 分鐘溶血素 (2 單位 )(ml)2%羊血球懸液 (ml)置 于 37 ?℃ 水 浴 15 分鐘結(jié)果 不溶血 稍溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 全溶血 不溶血 能引起完全溶血的最小補體量稱為準確單位，上表中第 3 管 (即 毫升 )，但因補體的效價可能有部分損失，故普通稍高的一管為實用單位，實際試驗時須用兩個實用單位。 上表的結(jié)果為： 補體標準單位： 毫升 補體實用單位： 毫升 補體兩個實用單位： 毫升 因試驗時是兩個實用單位的補體 毫升，可依下列比例關(guān)系換算： 20： =ⅹ： ⅹ = 即須將補體稀釋 倍，用 毫升則含有兩個實用單位。 (3) 抗原的滴定 在用已知抗原測定未知抗體時，必須先滴定抗原效價以決定本試驗時所需抗原的最適濃度 (反之用已知抗體測定未知抗原時，則需滴定抗體效價 ) 試 管號 劑 123456 1： 5 稀釋血清 －－－ 傷寒抗原 －－ －－ 痢疾抗 原 1： 80－ －－－－ 補體 生理鹽水－－ 搖勻放置 37℃水浴中 30min 溶血素 － 2％羊血球 搖勻放置 37℃水浴中 15min 說明試驗管特異性對照血清 對照抗原 對照溶血素對照羊血球?qū)φ? 如血清對照管呈完全或部分不溶血是為抗補體現(xiàn)象。血清嚴重污染細菌，混有淋巴液或顯著溶血時，常產(chǎn)生很強抗外體作用。又如試管、吸管不清潔，也可出現(xiàn)抗補體。若有抗補體發(fā)生，應(yīng)抽血重試驗 。 實驗五 T、 B 淋巴細胞分離試驗 淋巴細胞主要分 T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞兩大亞群，它們具有不同的特性和功能，為此在進行某些免疫學(xué)實驗時，首先需分離出純的 T淋巴細胞和 B 淋巴細胞。本試驗的原理為：淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物 (簡稱 AET)處理的綿羊紅細胞 (SRBC)混合后，其中全部 T淋巴細胞均能吸附 AET— SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的 E— 花環(huán)，較正常未處理的 SRBC 形成的 E— 花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細胞分層液 分離時， AET— E 花環(huán)易沉于管底，而未形成 E— 花環(huán)的 T淋巴細胞，用低滲液解花環(huán)周圍的 AET— SRBC，便可獲得純 T 淋巴細胞，而 B 淋巴細胞可直接取自分層液的界面。 材料及試劑： a) 新鮮豚鼠血 b) 兔紅細胞 (RRBC) c) 溴花二氨基異硫氫化物 (AET) d) 淋巴細胞分層液 e) 其它 Hanks 液，含小牛血清的 199 培養(yǎng)液，無菌生理鹽水， %氯化鈉溶液，離心機等。 方法： 1. AET— RRBC 制備 (1). AET 溶液的制備 稱取 AET 粉劑 402 毫克，溶于 10 毫升蒸餾水中，使成為 溶液，用 4N NaOH 溶液調(diào) 。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。 (2). AET 處理 RRBC 取洗滌好壓積的 RRBC，按一份壓積 AET— RRBC 加入 4 份新鮮配制的 的 AET溶液充分混勻置 37℃水浴 15 分鐘，每隔 5 分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口 (1— 2 厘米 )1800 轉(zhuǎn) /分離心 5分鐘。連續(xù)洗滌 3— 5 次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少 AET—RRBC 粘附成團，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛 血清的 199 培養(yǎng)基再洗一次，最后配成 10%AET— RRBC 懸液，置 4℃保存，不得超過 5 天。 (3).1%AET— RRBC 的配制： 將預(yù)先配制并保存于 4℃冰箱的 10%濃度的 AET— RRBC，以含 10%小牛血清的 199 培養(yǎng)液稀釋至 1%。 2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。 3. AET— E 花環(huán)試驗： 將分離的單個核細胞 (2ⅹ 106/毫升 )與等量 1%AET— RRBC 混合，置37℃水浴 15 分鐘，每隔 5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管 2— 3 毫升，低速離心 (1000 轉(zhuǎn) /分鐘 )5 分鐘后，移至 4℃冰箱 45 分鐘。 4. T 淋巴細胞和 B 淋巴細胞的分離 將形成 E— 花環(huán)的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細胞，即為富含 B 淋巴細胞群。沉淀于管底的 E— 花環(huán)，用Hanks 液洗一次后，加雙蒸水 3 毫升處理 3 分鐘，低滲裂解 E— 花環(huán)周圍的 RRBC，立即加 %氯化鈉溶液 1 毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含 T 淋巴細胞群。 實驗六 豚鼠 T 淋巴細胞的測定 —— 兔紅細胞玫瑰花環(huán)試驗 玫瑰花環(huán)試驗，又稱為花結(jié)試驗。是測定淋巴細胞數(shù)量和功能的一種方法。 人類 T和 B 淋巴細胞表 面具有不同的受體。由于人類 T淋巴細胞表面具有與綿羊紅細胞結(jié)合的受體，能與綿羊紅細胞非特異性結(jié)合，形成E 花環(huán)，因此， T 細胞也成為紅細胞花瓣形成細胞。根據(jù) E— 玫瑰花環(huán)形成率，可以間接判斷機體細胞免疫力。目前，已廣泛應(yīng)用于臨床，作為測定人群免疫狀態(tài)的一個指標。 材料： 1. 肝素 (100 單位 /毫升 ) 2. %兔紅細胞懸液 (用 Hanks 液配制 ) 3. 吸收過的胎牛血清： 取經(jīng) 56℃ 30 分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細胞混合后， 37℃水浴 20 分鐘， 2020 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘，取上 清液即成。 4. Hanks 液 5. 豚鼠抗凝血 6. 淋巴細胞分層液 7. 滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。 方法： 1. 淋巴細胞提取 (1) 取豚鼠抗凝血 2毫升，加 3毫升 Hanks液使之稀釋。加于 3 毫升淋巴細胞分層液液面之上 (沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混 )。 (2) 2020 轉(zhuǎn) /分離心 30 分鐘，吸淋巴細胞層到另一試管中加 5 倍體積的 Hanks 液洗 1— 2 次， (1500 轉(zhuǎn) /分離心 10 分鐘 )棄上清即成。 圖 8 用分層 液離心后的血細胞層 2. 加吸收過的胎牛血清 毫升， %兔紅細胞懸液 毫升，于淋巴細胞中。混合后， 37℃水浴 5 分鐘。 3. 500 轉(zhuǎn) /分離心 5 分鐘，放 4℃冰箱中 2 小時后，棄大部分上清。 4. 染色及觀察 輕輕懸浮沉積的細胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合， 10 分鐘后取一滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。 高倍鏡或油鏡下計數(shù) 200 個淋巴細胞，凡結(jié)合 3 個或 3 個以上的兔紅細胞者為陽性，計算花環(huán)形成細胞的百分率。 實驗七 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)測定傷寒桿菌“ O”抗體 酶聯(lián)免疫吸附試驗是用酶標記的抗體 (或 SPA)檢測未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是 ELISA 方法，間接法，雙抗體法和抗原法。本次試驗介紹，酶聯(lián)葡萄球菌蛋白 A 免疫分析法。ELISA 法原理如下，見圖 9 圖 9 ELISA－ SPA 法原理 1. 加抗原 使之吸附于固相載體 (如塑料反應(yīng)板 ) 2. 洗滌 加待測血清 3. 洗滌 加酶標記 SpA 4. 洗滌 加酶的底物。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。 材料： 1. 聚乙烯塑料反應(yīng)板 ( 時可吸附蛋白 Ag) 2. 抗原：傷寒桿菌 O901 煮沸或超聲波粉碎抗原 3. 待測血清 4. 凍干酶聯(lián)葡萄球菌 A 蛋白 (HRD— proteinA)純品 5. 鄰苯二胺 (OPD) 6. 包被液： 碳酸鈉 — 碳酸氫鈉溶液 7. 稀釋液： 10%免疫血清 PBS— 吐溫 20，防止非特異性吸附 8. 洗滌液： , 防止非特異性吸附 9. 底物溶液： 磷酸氫二鈉 毫升 檸檬酸 毫升 蒸餾水 50 毫升 臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解 40 毫克鄰苯二胺，然后加入30%雙氧水 毫升，底物對光敏感，需要避光并立即使用。 10. 終止液； 2M 硫酸 方法： 1．抗原包被 取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，于每孔內(nèi)加傷寒抗原 毫升 (用包被緩沖液稀釋，蛋白含量 10 微克 /毫升 )，置 37℃ 1 小時，棄抗原液，用洗滌液 3 次每次 3 分鐘。 2．加待測血清 于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度 (如 1： 5， 1： 10， 1： 20? 1： 80)的待測血清， PBS 空白對照，陰性對照血清，陽性對照血清各 毫升。置37℃ 30 分鐘，洗滌 3 次。 3．加酶聯(lián) A 蛋白 于每孔加酶聯(lián) A 蛋白各 毫升，置 37℃ 20 分鐘，洗滌 3 次。 4．加臨時配制的底物溶液各 毫升，置暗處 15 分鐘。加 2M 碳酸1 滴終止反應(yīng)。 ： (肉眼判斷 ) 若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據(jù)顏色深淺以 (+)表示。 綜合設(shè)計性實驗 實驗一 抗體產(chǎn)生細胞的檢測 ——