【文章內(nèi)容簡介】 出現(xiàn)沉淀線可判為陰性結(jié)果。放置過久可使沉淀線消失。4．此方法簡便易行，結(jié)果穩(wěn)定可靠；但靈敏度低，試驗所需時間長，且只能定性，不能定量，僅適用于大量普查項目?！咀⒁馐马棥?．所用載玻片要潔凈、邊緣無破損，否則難以澆制瓊脂板。2．緩沖瓊脂的溫度要適宜，溫度過高澆板時易外溢，同時表面蒸發(fā)量大，瓊脂板光潔度差；但溫度過低則瓊脂凝固過快，制板厚度不均勻，表面不光滑。3．澆制瓊脂板時動作要迅速，過于緩慢容易邊加邊凝，使瓊脂板凹凸不平。4．打孔時要小心，勿使瓊脂層脫離載玻片或瓊脂板底層開裂，以免加樣時順裂縫或底部散失。一旦出現(xiàn)裂縫或脫離現(xiàn)象，可向孔內(nèi)滴加少許溫瓊脂加以彌補或?qū)傊逶诨鹧娓咛巵砘赝ㄟ^幾次補底。5．為了使沉淀線保持清晰度，可在加樣完畢將瓊脂板置37℃下進行擴散，形成沉淀線后置室溫或4℃冰箱為佳。 三 單向免疫擴散試驗 【目的要】求要求掌握試驗原理、熟悉試驗方法及結(jié)果分析，了解其臨床意義。【實驗原理】 將一定量抗體混勻于瓊脂凝膠內(nèi)，凝膠孔中加入抗原，抗原向四周擴散的過程中與凝膠中的抗體發(fā)生反應(yīng)，在抗原與抗體比例合適處形成抗原抗體復合物，呈現(xiàn)白色沉淀環(huán)。沉淀環(huán)直徑的大小與孔中抗原濃度成正比。如預先用已知不同濃度的標準抗原制成標準曲線，可從已知的標準曲線上查出待檢標本中抗原的含量。 【器材試劑】1．標本 待檢人血清、免疫球蛋白工作標準（IgG含量10mg/ml）。2．試劑 羊抗人IgG診斷血清（單擴效價1∶60）、15g/L鹽水瓊脂。3．器材 三角燒瓶、載玻片、打孔器、吸管、滴管、濕盒、水浴箱、微量加樣器和半對數(shù)坐標紙等?！痉椒ú襟E】1．瓊脂準備 吸取已熔化瓊脂59ml于三角燒瓶中，置56℃水浴保溫，將預溫的羊抗人IgG診斷血清1ml與瓊脂充分混合，繼續(xù)保溫于56℃?zhèn)溆?。如果羊抗人IgG診斷血清的單擴效價不是1∶60，試驗時所需瓊脂量與抗體量的比例應(yīng)加以調(diào)整。2．澆板 ，注意澆板要均勻、平整、無氣泡、布滿整張載玻片。3．打孔 待瓊脂凝固后，用打孔器打孔，孔距10~12mm?？滓虻脠A整光滑，邊緣不要破裂，底部不要與載玻片脫離。如有脫離應(yīng)注意補底。4．加樣 將待檢血清用生理鹽水做1∶40稀釋，用微量加樣器取稀釋血清10μl加入相應(yīng)的試驗孔內(nèi)，每份標本加兩孔。如同時測定多個標本，注意做好標記，認真記錄，不要搞混。另外， 蒸餾水溶解，用生理鹽水稀釋成如下濃度：1∶1∶11∶1∶31∶40，分別加入另一套孔中，每孔中加10μl，用于制備標準曲線。5．擴散 將加樣完畢的瓊脂放于濕盒中，置室溫或37℃ 24h后觀察結(jié)果。6．繪制標準曲線 以各稀釋度工作標準的沉淀環(huán)直徑為橫坐標，相應(yīng)孔中IgG含量為縱坐標，在半數(shù)紙上繪制標準曲線?！窘Y(jié)果分析】1．精確測量各試驗孔沉淀環(huán)直徑，如果沉淀環(huán)不太圓，則取最大直徑和最小直徑的平均值。從標準曲線上查得相對應(yīng)的IgG含量，乘以稀釋倍數(shù)，即為待檢血清中IgG的實際含量。2．瓊脂單擴散試驗為定量測定法，常用于血清中IgG、IgA、IgM、補體、白蛋白、蛋白酶等物質(zhì)的定量測定，為臨床診斷提供參考指標。3．本方法比較穩(wěn)定，易于操作；但觀察結(jié)果需時間長，敏感度偏低，每次試驗均需做參考血清的標準曲線。【注意事項】1．澆制瓊脂板的事項同凝膠雙擴散試驗。2．每批試驗均應(yīng)同步繪制標準曲線。即檢測待檢血清所用瓊脂板應(yīng)和繪制標準曲線采用的瓊脂板為同一批瓊脂板。3．瓊脂熔化后置水浴中保溫時，溫度不可超過56℃，否則會使抗體變性；溫度也不可過低，否則瓊脂易凝固而不能澆制出很好的瓊脂板。 四 對流免疫電泳 【目的要求】本實驗以測定血清中AFP為例，要求掌握實驗原理、熟悉操作過程和結(jié)果分析；了解臨床應(yīng)用及意義。【實驗原理】對流免疫電泳實質(zhì)上是定向加速的電泳技術(shù)與免疫雙擴散技術(shù)的結(jié)合。在偏堿性的緩沖液環(huán)境和適當?shù)闹绷麟妶鲋校蟛糠挚乖瓗в休^多的負電荷，電泳力大于電滲力，向正極移動；而抗體（尤其是IgG）在同樣的環(huán)境中帶負電荷較少，而且其分子量又較大，加上凝膠內(nèi)較強的電滲作用，故抗體電泳力小于電滲力，向負極移動。試驗中將抗原放負極，抗體放正極，在一定的時間內(nèi)（約30~90min），移動的抗原與抗體在兩孔間相遇并發(fā)生反應(yīng)，在濃度比例適當時形成沉淀線?！酒鞑脑噭?．標本 待測人血清、陽性對照血清。2．試劑 AFP診斷血清、 、15g/L瓊脂（ ）。3．器材 電泳槽、電泳儀、孔型模板、打孔器、載玻片、吸管、微量加樣器、吸球、濾紙或紗布條等?！痉椒ú襟E】1．制板 。 2．打孔 待瓊脂凝固后成對打孔，孔徑為3mm，孔距為5mm。 3．加樣 做好抗原和抗體的標記（例如在無關(guān)緊要的邊緣打一小孔等），按標記分別加入抗原、抗體及陽性對照。4．電泳 將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，抗原孔置陰極端，抗體孔置陽極端，液面至槽高2/3處，瓊脂板兩端用濾紙條或紗布條與緩沖液相連。接通電源，~。電泳30~90min后切斷電源，取出瓊脂板觀察結(jié)果。 【結(jié)果分析】1．待測孔與抗血清之間出現(xiàn)沉淀線為陽性，否則為陰性。2．陽性結(jié)果的沉淀線位置與抗原和抗體分子的電荷情況有關(guān)，也與抗原和抗體的濃度比例有一定關(guān)系。3．對流免疫電泳實際上是電場作用下的瓊脂雙擴散試驗，操作簡便，觀察結(jié)果快，敏感度比瓊脂雙擴散法高8~16倍。制作瓊脂板時必須選擇高電滲作用的普通瓊脂，還要選擇高特異性、高親和力的抗體，否則結(jié)果難以解釋。4．該方法可用于抗原的半定量測定或根據(jù)沉淀線的位置、形狀做抗原和抗體相對濃度的分析。但分辯率較差，當有多種抗原抗體系統(tǒng)存在時，形成的沉淀線常形成重疊，難以分辯清楚，所以用作此目的時，反倒不如瓊脂雙擴散試驗。【注意事項】1．澆制瓊脂板的注意事項同瓊脂雙擴散試驗。2．搭橋時應(yīng)注意與凝膠接觸緊密，否則會使電流不均勻，致使沉淀線歪斜、不均勻。3．電泳時抗原、抗體電極方向不可放反。4．電泳時間和電流強度及孔間距有關(guān)，電泳時電流不可太大，以免蛋白質(zhì)變性，孔間距如果較大應(yīng)適當延長電泳時間。5．電泳完畢，先斷電源（不僅關(guān)閉電源按鈕，一定要脫開電泳槽和電泳儀之間的連接線，以防積蓄電壓觸電），再取出電泳板。6．抗體或抗原要根據(jù)所標效價做適當稀釋，多做幾個稀釋度，選擇最適的比例關(guān)系。 五 火箭電泳 【目的要求】要求掌握火箭電泳的原理，熟悉其操作方法，了解其應(yīng)用。實驗原理將凝膠單擴散的瓊脂板置人直流電場，板孔中的抗原因帶有負電荷會在含有抗體的離子瓊脂中向正極泳動，并于比例合適處與抗體發(fā)生反應(yīng)，在泳道上形成可見的沉淀帶。泳動中的抗原濃度越來越小，沉淀帶越來越窄，直至全部抗原與抗體結(jié)合，形成一個錐形的沉淀峰。整個沉淀帶的形狀呈火箭樣，故名火箭電泳。抗原含量越高，所形成的火箭峰就越長。將沉淀峰與事先用已知不同濃度的標準抗原制成的標準曲線比較，即可得出標本中抗原的含量。 【器材試劑】 1．標本 待檢人血清、陽性血清(臍帶血清)。 2．試劑 抗AFP抗體、 ／L巴比妥緩沖液、精制瓊脂粉或瓊脂糖等。 3．器材 電泳槽、電泳儀、打孔器、水浴箱、玻璃板、吸管、三角燒瓶和微量加樣器等。 【方法步驟】 1． ／L巴比妥緩沖液，在三角燒瓶內(nèi)加熱熔化。 2．將熔化好的瓊脂置56℃恒溫水浴中預溫，待溫度平衡(瓊脂膠溫度為56℃)后，將抗AFP抗體加到瓊脂液中，二者比例為1∶30。搖勻后迅速澆制瓊脂板。 3．待瓊脂凝固后在瓊脂板的一端(距板端約5mm)打孔，孔徑3mm，孔間距6～8mm，孔的數(shù)目根據(jù)需要而定。 4．向每孔加入不同稀釋度的待檢血清，其稀釋倍數(shù)分別是80。另外，向另一板的孔中加入系列已知濃度的陽性血清或其他抗原，用來繪制標準曲線。 5． ／L巴比妥緩沖液至槽高的2／3處。將加樣完畢的瓊脂板置電泳槽的支架上，將打孔加樣端置陰極，用濾紙或紗布條將凝膠板與電泳液相連。接通電源，調(diào)整電流強度在2～4mA／cm板寬。電泳1～2h可見火箭峰的出現(xiàn)。 6．電泳結(jié)束后，切斷電源，取下瓊脂板，如沉淀峰清晰可見，可直接判讀結(jié)果，否則將瓊脂板浸入10g／L鞣酸生理鹽水中10分鐘，可使沉淀峰更明顯。如欲永久保留，可將瓊脂板進行染色干燥處理。 【結(jié)果分析】 1．首先測量已知抗原的火箭峰高度，以此為橫坐標，以對應(yīng)濃度為縱坐標作圖，繪制出標準曲線。待測樣品的定量可根據(jù)峰高從標準曲線上查出。 2．火箭峰高度與孔中抗原濃度呈正相關(guān)，與凝膠中抗體濃度呈負相關(guān)。但抗原濃度過高則在瓊脂板上看不到峰頂；而抗體濃度過高則沉淀峰太低，降低試驗的敏感度。 3．沉淀峰呈尖角狀表示無游離抗原，泳動已到終點；前端呈鈍圓形或云霧狀則表示還未到終點，應(yīng)繼續(xù)電泳。 4．用多價抗血清時每個火箭可出現(xiàn)多個子峰；抗原與抗體比例不適合或電泳條件不適當時不出現(xiàn)火箭峰。 5．與前述幾個電泳方法相比，火箭電泳操作簡便省時，結(jié)果重復性好，／m1。6．如在抗原標本中加入微量放射性核素，電泳后具有放射性的沉淀帶在暗室中可使膠片感光，感光峰比凝膠中肉眼可見的火箭峰高得多——此法稱火箭電泳放射自顯影，檢測靈敏度可提高40～60倍。 【注意事項】 1．凝膠單擴散中的注意事項在此均適用，例如加入抗體時要嚴格掌握瓊脂膠的溫度，抗原與抗體的濃度應(yīng)預先試驗。 2．應(yīng)選擇電滲作用最小的精制瓊脂粉或優(yōu)質(zhì)瓊脂糖來制備凝膠，而不用普通瓊脂。 3．打孔完畢，可先將瓊脂板放在電泳槽上，低電流通電后再加樣，加樣后立即加大電流。這樣可防止抗原液向孔四周擴散，使火箭峰形狀良好，敏感性增加。這一做法適用于所有打孔加樣的凝膠電泳。使用低電壓、低離子強度、電泳時間長些，效果會更好。4．，IgG、因此要使IgG、IgA等在電場中也向正極泳動，應(yīng)先經(jīng)乙?；?、甲?；虬奔柞；幚韥碓黾铀鼈兊呢撾姾?。甲酰化的方法：取待檢血清若干，％甲醛稀釋至分析要求的濃度，室溫30min，即可使蛋白質(zhì)分子中的氨基與甲醛發(fā)生縮合反應(yīng)，該反應(yīng)抑制了蛋白質(zhì)分子中堿性基團的解離，使其形成某種酸。 六 免疫電泳 【目的要求】本試驗以鑒定人血清IgG提取物的純度為例，掌握免疫電泳的原理，熟悉操作方法，了解結(jié)果分析及臨床應(yīng)用。【實驗原理】免疫電泳(immunoeletrophoresis，IEP)是瓊脂區(qū)帶電泳和凝膠雙擴散相結(jié)合的一種免疫技術(shù)。試驗時先進行瓊脂凝膠電泳，將樣品中不同分子量和不同電荷的組分分離成若干區(qū)帶；然后與電泳方向平行挖一小槽，加入含相應(yīng)抗體的免疫血清，與已分離的各抗原成分在瓊脂中作雙向免疫擴散。各區(qū)帶蛋白在相應(yīng)位置與抗體形成弧形沉淀線。根據(jù)沉淀弧的位置、數(shù)量和形態(tài)，可分析樣品中所含抗原成分及其性質(zhì)。 【器材試劑】 1．標本 正常人血清、待鑒定的人IgG提取液。 2．試劑 兔抗人全血清、 ／L巴比妥緩沖液、12g／L瓊脂巴比妥液 凝膠、凝膠指示劑( )等。 3．器材 電泳儀、電泳槽、37℃溫箱、恒溫水浴箱、水平臺、載玻片、吸管、3mm打孔器、孔型樣板、尖頭棉簽棒、毛細滴管、手術(shù)刀片、濕盒等。 【方法步驟】 1．瓊脂板制備 加熱熔化巴比妥瓊脂膠，用粗口吸管吸取4ml瓊脂膠，澆注到置于水平臺上的潔凈載玻片上。凝固后按孔型樣板打孔、開槽。槽可用刀片劃制，也可用模具在澆注前放到載玻片上；打孔開槽時要求外壁整齊，防止瓊脂破裂。，孔徑3mm(可加樣品10μl)，～2mm。 2．加樣 用微量加樣器吸取正常人血清和待檢的人IgG各10μl分別加入兩個樣品孔中，注意不要外溢。為便于觀察樣品泳動位置可在正常人血清中加微量氨基黑染液。 3．電泳 將瓊脂板置于電泳槽內(nèi)進行電泳。控制電流2～4mA／cm板寬，可終止電泳()。 4．雙擴散 電泳后取出瓊脂板，向槽中加入預溫的瓊脂膠封底。用毛細滴管加入抗人全血清，充滿槽內(nèi)，勿使外溢。將板平置濕盒內(nèi)，置37℃溫箱擴散24h后觀察結(jié)果。 【結(jié)果分析】 1．觀察已分離的血清抗原成分與相應(yīng)抗體形成的沉淀弧。根據(jù)正常人血清各蛋白成分所處的電泳位置可分為白蛋白(Alb)區(qū)、球蛋白α區(qū)、β區(qū)和γ區(qū)。待鑒定的提純?nèi)薎gG的沉淀弧應(yīng)主要在γ區(qū)，并可延伸到β區(qū)，甚至α區(qū)。如出現(xiàn)兩條以上沉淀線，則指示提取物不純。 2．若抗原抗體反應(yīng)形成的沉淀線很弱，肉眼難見，可將瓊脂板用生理鹽水浸泡10h (其間應(yīng)換液數(shù)次)，以去除未反應(yīng)的蛋白。再將板浸入10～40g／L鞣酸水溶液中，10min后取出觀察，可增加沉淀線的清晰度。 3，如欲制作染色標本，可將瓊脂板浸泡于生理鹽水中24～48h，其間換水2～3次，以除去未反應(yīng)的蛋白，再用蒸餾水浸泡2h除鹽，然后于板上覆蓋用水浸濕的棉布一塊，置于37℃溫箱過夜，使其干燥，再浸入氨基黑染液中染10～20min，用脫色液脫色，保存。 4．免疫電泳的主要優(yōu)點不僅是加快沉淀反應(yīng)的速度，而且樣品用量少、特異性和分辨率高，可鑒定混合樣品中的不同抗原組分。但免疫電泳技術(shù)的分辨率也受很多因素的影響，如抗原抗體比例、抗血清的抗體譜、以及影響區(qū)帶電泳的各種因素：緩沖液、瓊脂、電流等。 5．免疫電泳主要應(yīng)用于復雜抗原和抗體成分的分析、或其提取物的純度鑒定。臨床上常用于骨髓瘤、γ球蛋白缺乏癥、肝臟疾病、白血病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等患者血清蛋白成分的分析。 【注意事項】 1．抗原與抗體均不能溢出孔外或槽外，防止沉淀線彎曲。 2．抗原抗體比例需適當，抗體過多時清晰的沉淀帶減少；抗原過多會出現(xiàn)弧線融合或消失。所測抗原的蛋白含量一般應(yīng)在20g／L以下，若過高需用緩沖液稀釋。 3．為防止電泳后兩個緩沖槽中緩沖液的pH與離子強度有所改變，每次電泳后應(yīng)更換陰陽電極，或?qū)刹壑械木彌_液混合。 七 免疫濁度測定