【文章內(nèi)容簡介】 ，首先需分離出純的T淋巴細胞和B淋巴細胞。本試驗的原理為：淋巴細胞與用溴花二氨基異硫氫化物（簡稱AET）處理的綿羊紅細胞（SRBC）混合后，其中全部T淋巴細胞均能吸附AET—SRBC，形成牢固穩(wěn)定而巨大的E—花環(huán)，較正常未處理的SRBC形成的E—花環(huán)百分比為高，而且形成快速，不易脫落，重復(fù)性好。再經(jīng)淋巴細胞分層液分離時，AET—E花環(huán)易沉于管底，而未形成E—花環(huán)的T淋巴細胞，用低滲液解花環(huán)周圍的 AET—SRBC，便可獲得純T淋巴細胞，而B淋巴細胞可直接取自分層液的界面。材料及試劑：a) 新鮮豚鼠血b) 兔紅細胞（RRBC）c) 溴花二氨基異硫氫化物（AET）d) 淋巴細胞分層液e) 其它Hanks液，含小牛血清的199培養(yǎng)液，無菌生理鹽水，%氯化鈉溶液，離心機等。方法：1. AET—RRBC制備（1）. AET溶液的制備稱取AET粉劑402毫克，溶于10毫升蒸餾水中，用4N 。該溶液必須新鮮配制，不宜久存。（2）. AET處理RRBC取洗滌好壓積的RRBC，按一份壓積AET—℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次。取出加冷無菌生理鹽水至離心管口（1—2厘米）1800轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。連續(xù)洗滌3—5次，每洗一次，必須充分搖勻，以減少AET—RRBC粘附成團，并觀察有無溶血。若有溶血現(xiàn)象，則用含小牛血清的199培養(yǎng)基再洗一次，最后配成10%AET—RRBC懸液，置4℃保存，不得超過5天。（3）.1%AET—RRBC的配制：將預(yù)先配制并保存于4℃冰箱的10%濃度的AET—RRBC，以含10%小牛血清的199培養(yǎng)液稀釋至1%。2. 從新鮮豚鼠血液分離單個核細胞，操作見后試驗。3. AET—E花環(huán)試驗：將分離的單個核細胞（2ⅹ106/毫升）與等量1%AET—RRBC混合，置37℃水浴15分鐘，每隔5分鐘搖勻一次，分裝數(shù)管，每管2—3毫升，低速離心（1000轉(zhuǎn)/分鐘）5分鐘后，移至4℃冰箱45分鐘。4. T淋巴細胞和B淋巴細胞的分離將形成E—花環(huán)的細胞懸液，再用淋巴細胞分層液分離，吸取界面云霧狀的細胞，即為富含B淋巴細胞群。沉淀于管底的E—花環(huán)，用Hanks液洗一次后，加雙蒸水3毫升處理3分鐘，低滲裂解E—花環(huán)周圍的RRBC，%氯化鈉溶液1毫升，使還原為等滲，低速離心沉淀，即得富含T淋巴細胞群。實驗六 豚鼠T淋巴細胞的測定——兔紅細胞玫瑰花環(huán)試驗玫瑰花環(huán)試驗，又稱為花結(jié)試驗。是測定淋巴細胞數(shù)量和功能的一種方法。人類T和B淋巴細胞表面具有不同的受體。由于人類T淋巴細胞表面具有與綿羊紅細胞結(jié)合的受體，能與綿羊紅細胞非特異性結(jié)合，形成E花環(huán)，因此，T細胞也成為紅細胞花瓣形成細胞。根據(jù)E—玫瑰花環(huán)形成率，可以間接判斷機體細胞免疫力。目前，已廣泛應(yīng)用于臨床，作為測定人群免疫狀態(tài)的一個指標。材料：1. 肝素（100單位/毫升）2. %兔紅細胞懸液（用Hanks液配制）3. 吸收過的胎牛血清：取經(jīng)56℃30分鐘加熱滅活后的胎牛血清加半量壓積兔紅細胞混合后，37℃水浴20分鐘，2000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，取上清液即成。4. Hanks液5. 豚鼠抗凝血6. 淋巴細胞分層液7. 滅菌注射器，針頭，試管，吸管等。方法：1. 淋巴細胞提?。?） 取豚鼠抗凝血2毫升，加3毫升Hanks液使之稀釋。加于3毫升淋巴細胞分層液液面之上（沿管壁輕輕加入，勿使兩液相混）。（2） 2000轉(zhuǎn)/分離心30分鐘，吸淋巴細胞層到另一試管中加5倍體積的Hanks液洗1—2次，（1500轉(zhuǎn)/分離心10分鐘）棄上清即成。圖8 用分層液離心后的血細胞層2. ，%，于淋巴細胞中。混合后，37℃水浴5分鐘。3. 500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，放4℃冰箱中2小時后，棄大部分上清。4. 染色及觀察輕輕懸浮沉積的細胞。向懸液中滴一滴美蘭液，混合，10分鐘后取一滴放載玻片上，加蓋玻片鏡檢。高倍鏡或油鏡下計數(shù)200個淋巴細胞，凡結(jié)合3個或3個以上的兔紅細胞者為陽性，計算花環(huán)形成細胞的百分率。實驗七 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）測定傷寒桿菌“O”抗體酶聯(lián)免疫吸附試驗是用酶標記的抗體（或SPA）檢測未知抗原或抗體的方法。此法敏感性高，特異性強。常用的是ELISA方法，間接法，雙抗體法和抗原法。本次試驗介紹，酶聯(lián)葡萄球菌蛋白A免疫分析法。ELISA法原理如下，見圖9圖9 ELISA－SPA法原理1. 加抗原 使之吸附于固相載體（如塑料反應(yīng)板）2. 洗滌 加待測血清3. 洗滌 加酶標記SpA4. 洗滌 加酶的底物。經(jīng)酶的催化產(chǎn)生有色產(chǎn)物。材料：1. 聚乙烯塑料反應(yīng)板（）2. 抗原：傷寒桿菌O901煮沸或超聲波粉碎抗原3. 待測血清4. 凍干酶聯(lián)葡萄球菌A蛋白（HRD—proteinA）純品5. 鄰苯二胺（OPD）6. 包被液：—7. 稀釋液：10%免疫血清PBS—吐溫20，防止非特異性吸附8. 洗滌液： ,9. 底物溶液： 蒸餾水50毫升臨用前新鮮配制，在上述緩沖液中溶解40毫克鄰苯二胺，然后加入30%，底物對光敏感，需要避光并立即使用。10. 終止液；2M硫酸方法：1．抗原包被取潔凈的聚苯乙烯微量反應(yīng)板，（用包被緩沖液稀釋，蛋白含量10微克/毫升），置37℃1小時，棄抗原液，用洗滌液3次每次3分鐘。2．加待測血清于每孔內(nèi)分別加不同稀釋度（如1：5，1：10，1：20…1：80）的待測血清，PBS空白對照，陰性對照血清。置37℃30分鐘，洗滌3次。3．加酶聯(lián)A蛋白，置37℃20分鐘，洗滌3次。4．，置暗處15分鐘。加2M碳酸1滴終止反應(yīng)。：（肉眼判斷）若顏色于陰性對照相同則為陰性，若較陰性對照深則為陽性，根據(jù)顏色深淺以（+）表示。綜合設(shè)計性實驗實驗一 抗體產(chǎn)生細胞的檢測——溶血空斑實驗（綜合性實驗）取綿羊細胞免疫的小鼠脾臟，制成脾細胞懸液，與一定量的指示細胞（綿羊細胞）和補體結(jié)合，注入自制的小室內(nèi)，經(jīng)37℃孵育后，單個散在的抗體形成釋放抗體，抗體與周圍的綿羊紅細胞（抗原）結(jié)合，并在補體參與下，使綿羊細胞溶解，結(jié)果在抗體形成細胞周圍形成肉眼可見的圓形透明溶血區(qū)——溶血空斑。計算溶血空斑數(shù)目，則可推算脾內(nèi)存在的抗體產(chǎn)生細胞總數(shù)。材料：1. 20—22克健康小鼠2. 解剖器械3. 注射器，平皿，漏斗，紗布，研缽4. 20%綿羊紅細胞懸液5. 潔凈脫脂載玻片（75ⅹ25毫米），蓋玻片（22ⅹ22毫米）。6. ，凡士林油。7. 微量加樣器8. 指示細胞懸液，配制方法如下：10%綿羊紅細胞 補體（新鮮豚鼠血清） 含5%小牛血清的Hanks液 2毫升 混合后水浴備用方法：1．免疫動物取25%綿羊紅細胞懸液1毫升，無菌操作注入小鼠腹腔中2．脾細胞液的制備（1）小鼠免疫4天后，頸椎脫位處死，取脾臟，去除脂肪組織，放平皿內(nèi)，用冷Hanks液洗1—2次。（2）取出脾臟研缽中研碎，加Hanks液2—3毫升，用吸管反復(fù)吹打數(shù)次，使細胞分散。將此細胞懸液經(jīng)4—8層紗布過濾，1500轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，棄上清。如細胞太多，可加蒸餾水4毫升迅速混勻，半分鐘后立即加入等量Hanks液混勻1000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘，棄上清。（3）沉淀細胞用Hanks液洗1—2次，棄上清后，加Hanks液使總量達5毫升。用乳頭吸管吹打使沉淀細胞懸起混勻，此即為50倍稀釋的脾細胞。（4）。*脾細胞懸液制備過程中應(yīng)在冰水浴中進行。3．玻片小室的制作取潔凈（無油）的載玻片，按下圖粘三條透明膠帶，在膠帶上薄涂一層凡士林（勿涂到小室內(nèi)），然后用鑷子取兩個蓋片，分別放在其上，制成兩個小室。用鑷子尾端將蓋片壓平貼牢（保持小室一定體積）。用凡士林將蓋片底端（其中的任一端）封住，頂端作為注入細胞混合液。 圖10玻片小室示意圖4．細胞混合液的配制取小試管一只，，混勻即為被檢的細胞混合懸液。5．混合細胞的灌注用100ul的微量加樣器吸取被檢細胞混合懸液，于小室開口一端輕輕將液體注滿小室（勿使氣泡產(chǎn)生，勿使液體外溢），記錄實際注入的細胞懸液微升數(shù)（約70ul）每個樣品注2個小室，取其平均值。6．用牙簽粘取少許凡士林益封小室開口。7．將作好的標本水平置濕盒中，放37℃溫箱中孵60分鐘8．溶血空斑計數(shù)肉眼觀察空斑并計數(shù)兩個小室出現(xiàn)的溶血空斑數(shù)。對模糊不清的空斑可在低倍鏡下檢查，真正的溶血空斑必須中心有一個淋巴細胞，周圍為透明區(qū)。全脾臟中抗體產(chǎn)生細胞總數(shù)可依下述公式計算：實驗二 抗原和免疫血清的制備（設(shè)計性實驗）抗體是機體接受抗原刺激后產(chǎn)生的一種具有免疫特異性的球蛋白。在免疫學(xué)實踐，為制備抗體常以抗原性物質(zhì)（細菌、病毒、類毒素、血清及其他蛋白質(zhì)）給動物注射。經(jīng)過一定時間后，動物血清中可以產(chǎn)生大量的特異性抗體。這種含有特異性抗體的血清稱為免疫血清。免疫血清不但對傳染病的診斷、預(yù)防和治療有重要意義，而且對器官移植，腫瘤以及某些科研工作也有重要意義?？贵w的產(chǎn)生通常與抗原的質(zhì)和量、動物種類以及接種途徑有密切關(guān)系。因此在制備免疫血清時要根據(jù)抗原的不同選擇適宜的動物種類和免疫方法。一． 抗菌血清的制備材料：1. 動物：家兔2. 菌種：傷寒桿菌H901，傷寒桿菌O9013. 培養(yǎng)基：普通培養(yǎng)基4. 其它：%甲醛鹽水，%石灰酸鹽水，無菌生理鹽水，標準比濁管，離心機。方法：1. 抗原的制備：標準菌株的選擇：所用的菌種傷寒桿菌H901和傷寒桿菌O901應(yīng)具有典型形態(tài)菌落及生化反應(yīng)。在生理鹽水中不發(fā)生自身凝集，與特異血清有高度凝集者可作為菌種。2. 菌液的制備Ⅰ.原液制備：H菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株接種于普通瓊脂的克氏瓶或大試管內(nèi) 37℃孵育18—24小時。肉眼觀察有無雜菌生長，必要時作鏡檢。用無菌甲醛生理鹽水洗下菌苔，將洗下液體裝入無菌試管內(nèi)，置37℃恒溫箱18—24小時以殺菌。得到原液。用作無菌試驗即將菌液接種于肉湯及瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)4天，無活菌生長者才可使用。O菌液的制備：將合格的傷寒桿菌H菌株依上法培養(yǎng)后，%石灰酸鹽水將菌苔洗下，洗液裝入無菌試管置于37℃溫箱中18—24小時殺菌得原液。經(jīng)檢查無菌時可以使用（如無傷寒桿菌O菌株也可用H菌株制備O抗原。%石灰酸生理鹽水洗下H菌菌液置100℃水浴60分鐘，破壞其H抗原即為O菌液。Ⅱ.應(yīng)用液的制備：合格的原液用標準比濁管計算含菌落數(shù)目后，用生理鹽水稀釋至每毫升含菌10億。%，制備好的原液及應(yīng)用液均保存在2—10℃冰箱中備用，有效期為1年。菌液濃度的計算及稀釋法：菌液的濃度可用麥克法倫特氏標準比濁法來測定，方法如下：（1） 分別配制1%硫酸溶液及1%氯化鋇溶液（2） 取口徑相等質(zhì)地相同的試管10支，依下表所示分別將硫酸及氯化鋇溶液加入，封固管口，注明號碼備用。管號123456789101%BaCl2(ml)0. 91%H2SO4(ml)相當菌數(shù)（億/ml）36912151821242730（3） 將洗下的細菌原液放入與比濁管相同的試管中并予以一定稀釋。與標準比濁管相比較，視其濁度相當于比濁管的第幾管，然后將比濁管相當菌數(shù)乘以稀釋倍數(shù)即可得到每毫升中所含細菌的數(shù)量。如細菌原液1：5稀釋后其濁度與第3管相當，則原液每毫升含菌數(shù)為9ⅹ5=45億。（4） 菌液的稀釋可按下列公式計算：=所需加鹽水的毫升數(shù)（原液毫升數(shù)原液每毫升含菌數(shù)）欲得稀釋液濃度— 原液毫升如原液5毫升，每毫升含菌45億今欲稀釋為每毫升含菌10億的溶液應(yīng)加生理鹽水的毫升數(shù)：（545）/（105）=。3．免疫方法（1） 選擇體重2—3千克的健康雄兔2—3只，由耳靜脈采血1毫升，分離血清。與進行免疫用的細菌做凝集試驗，測定有無天然凝集素。如無或微量時，該動物可用于免疫。（2） 將已稀釋的抗原按以下劑量及程序注入兔耳靜脈。日期第1天第5天第10天第15天第20天注射劑量1ml2ml（3） 末次注射后7天耳靜脈采血1毫升，分離血清。用上述菌液作試管凝集試驗，滴定抗菌血清中抗體的效價，效價在1：2000以上可放血。若效價不高可再增量注射菌液1—2次，再行試血。試血合格可頸動脈放血（方法見附錄）。分離血清，加入防腐劑（如萬分之一的硫化汞）放4℃保存?zhèn)溆?。（溶血素）的制備材料?． 動物：家兔2． 紅細胞懸液3． 其它：無菌生理鹽水，保存液（阿氏液）等方法：2. 紅細胞懸液的制備（1） 采血采取的綿羊血與滅菌的保存液等量混合，置冰箱中，可保存數(shù)周，也可用抗凝方法（2） 洗滌血球先將抗凝血液離心沉淀（2000cpmⅹ5分鐘）吸去上清。加入2—3倍的生理鹽水并用毛細滴管反復(fù)吹打混勻，離心沉淀5分鐘，吸去上清液。如此連續(xù)洗3次，最后一次可離心沉淀10分鐘以使血球密集管底。直至上清液透明無色再吸去上清夜，留密集血球備用。洗滌4次則血球變脆不適于使用。（3） 用生理鹽水將紅血球配成需要濃度，即為試驗用的血球懸液。如需10%血球懸液時，則吸取1毫升洗滌后的紅血球加生理鹽水9毫升即成。3. 免疫方法（1） 選擇2—3千克健康雄兔，按如下劑量及程序免疫：日期劑量（毫升）途徑第1天全血 皮內(nèi)第3天全血 皮內(nèi)第5天全血 皮內(nèi)第7天全血 皮內(nèi)第9天全血 皮內(nèi)第12天 20%紅細胞懸液全血 靜脈第15天 20%紅細胞懸液全血 .0靜脈（2） 末次注入后7天，耳靜脈采血1毫升，滴定血液單位達1：2000以上可頸動脈放血，分離血清，放等量甘