【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 種物理吸附是非特異性的，受蛋白質(zhì)的分子量、等電點(diǎn)、濃度等的影響。大分子蛋白質(zhì)較小分子蛋白質(zhì)通常含有更多的疏水基團(tuán)，故更易吸附到固相載體表面。 不易吸附 的非蛋白質(zhì)抗原可用間接包被的抗原經(jīng)固相抗體的親和層析作用，包被在固相上的抗原純度大大提高，因此含雜質(zhì)較多的抗原也可采用捕獲包被法。 親和素生物素 即用親和素先包被載體，加入生物素化的 DNA，這種包被方法均勻、牢固，已擴(kuò)大應(yīng)用于各種抗原物質(zhì)的定量測(cè)定。 脂類(lèi)物質(zhì) 無(wú)法與固相載體結(jié)合，可將其在有機(jī)溶劑（例如乙醇）中溶解后加入 ELISA板孔中，開(kāi)蓋置冰箱過(guò)夜或冷風(fēng)吹干，待酒精揮發(fā)后，讓脂質(zhì)自然干固在固相表面。 優(yōu)點(diǎn)：試驗(yàn)的特異性、敏感性均由此得以改善，重復(fù)性亦佳?？乖昧可?，僅為直接包被的 1/10乃至于 /100。 ? 包被條件： 包被液： 、 、 pH78的 TrisHCL緩沖液。 ? 加入包被液后，在 48℃ 冰箱中放置過(guò)夜， 37℃ 中保溫 2小時(shí)。包被濃度隨載體和包被物的性質(zhì)可有很大的變化，每批材料需通過(guò)實(shí)驗(yàn)與酶結(jié)合物的濃度協(xié)調(diào)選定。一般蛋白質(zhì)的包被濃度為 10ng/ml20ug/ml。 ? 包被緩沖液的選擇要依靠你所包被的物質(zhì)而定，沒(méi)有絕對(duì)的選擇，但有一個(gè)原則就是要盡可能的保持包被物的活性不被損失。目前常用的包被緩沖液有 PBS、 CBS、 tris鹽緩沖液、咪脞緩沖液等，一般來(lái)說(shuō)，緩沖液的 pH要大于蛋白質(zhì)的 pI，以保持其活性。 ? 堿性包被液如碳酸緩沖液用的較多，尤其是在小分子和載體蛋白的偶聯(lián)物的包被，其主要的優(yōu)勢(shì)在于堿性環(huán)境可以使蛋白更容易與板子結(jié)合。也有用 PBS和檸檬酸緩的，但是比較少見(jiàn)。 ? 洗滌： ? ELSIA洗滌：達(dá)到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的。常用的洗滌液為含 % 吐溫 20的磷酸鹽緩沖液，洗滌 3次， 5 min/次。 ? 清除殘留在板孔中游離的物質(zhì)，以及非特異性地吸附的干擾物質(zhì)。聚苯乙烯等塑料對(duì)蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時(shí)又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來(lái)。 ? 可以說(shuō)在 ELISA操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù)。 ? 封閉： ? 封閉 (blocking)是繼包被之后用高濃度的無(wú)關(guān)蛋白質(zhì)溶液再包被的過(guò)程。封閉就是讓大量不相關(guān)的蛋白質(zhì)充填這些空隙，從而避免 ELISA后續(xù)步驟中抗原或抗體與固相載體的直接吸附。 ? 常用封閉劑： %%的 BSA。 10%的小牛血清或 1%明膠 。脫脂奶粉 ,比較價(jià)廉，可以高濃度使用（ 5%）。 ? 所有的 ELISA固相均需封閉。 ? 孵育： ? 抗原抗體完成反應(yīng)的保溫過(guò)程稱(chēng)為孵育，通常 37℃ 孵育 h。 ? 應(yīng)注意孵育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。為保證這一點(diǎn)，一個(gè)人操作時(shí)，一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 ? 顯色： ? 于各反應(yīng)孔加入臨時(shí)配制的 TMB底物溶液 ml， 37℃ 反應(yīng) 1030 min。 ? 顯色是酶催化無(wú)色的底物生成有色產(chǎn)物的溫育反應(yīng)。反應(yīng)的溫度和時(shí)間仍是影響顯色的因素。在一定時(shí)間內(nèi)，陰性孔可保持無(wú)色，而陽(yáng)性孔則隨時(shí)間的延長(zhǎng)而呈色加強(qiáng)。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進(jìn)行。 ? 結(jié)果測(cè)定： ? 于各反應(yīng)孔加入 2M硫酸 ml，終止反應(yīng)；拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀中。于 450 nm處，以空白孔調(diào)零后測(cè)定各孔 OD值。 ? 結(jié)果判定： ? 目測(cè)定性法：加入底物經(jīng)酶解和終止反應(yīng)后，肉眼觀察陽(yáng)性孔顏色明顯深于 (競(jìng)爭(zhēng)法則淺于 )陰性對(duì)照；與陰性對(duì)照的顏色接近者，判定為陰性。 ? 以 P/N值 (陽(yáng)性孔 OD值 /陰性孔 OD值 )大于或等于 ； P/N值小于 ，但大于 ； P/N小于 。 對(duì)照設(shè)定 ? 陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照是檢驗(yàn)試驗(yàn)有效性的控制品，同時(shí)也是作為判斷結(jié)果的對(duì)照。 ? 陽(yáng)性對(duì)照的基本組成應(yīng)盡量與檢測(cè)標(biāo)本的組成一致，多以含蛋白保護(hù)劑的緩沖液為基質(zhì)。 ? 陰性對(duì)照品須先行檢測(cè)確定不含待測(cè)物質(zhì)。 ? 參考標(biāo)準(zhǔn)品：定量測(cè)定應(yīng)含有制作標(biāo)準(zhǔn)曲線用的參考標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)包括覆蓋可檢測(cè)范圍的 45個(gè)濃度。 ELISA的應(yīng)用 ? ELISA應(yīng)用的范圍很廣，而且正在不斷地?cái)U(kuò)大，原則上 ELISA可用于檢測(cè)一切抗原、抗體及半抗原，可以直接定量測(cè)定體液中的可溶性抗原。 ? 檢查抗原和半抗原方面：在內(nèi)分泌方面已經(jīng)用于檢測(cè)雌性激素、絨毛膜促性腺激素、黃體素、胰島素、皮質(zhì)醇、促甲狀腺素和孕酮等，其敏感性與RIA相當(dāng)，在血液學(xué)方面可用于檢查凝固因子（如第 Ⅷ 凝固因子）、紅細(xì)胞抗原及結(jié)合球蛋白（ Hapto Globin）等，在腫瘤方面已試用檢查甲胎蛋白（ AFP）癌胚抗原（ CEA）。 ? 檢查抗體方面：用 ELISA間接法檢查抗體，已獲得對(duì)多種傳染病和寄生蟲(chóng)病的血清學(xué)診斷，亦開(kāi)始廣泛用于現(xiàn)場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查。在寄生蟲(chóng)病方面，它用于對(duì)瘧原蟲(chóng)、阿米巴、利日曼原蟲(chóng)、錐蟲(chóng)、血吸蟲(chóng)、囊蟲(chóng)、弓漿蟲(chóng)、肺吸蟲(chóng)、肝吸蟲(chóng)、血絲蟲(chóng)、旋毛蟲(chóng)病等血清學(xué)診斷；在免疫性疾病方面有試用作自身疫病抗體測(cè)定以及對(duì)過(guò)敏的診斷，例如檢測(cè)各種過(guò)敏原的抗體、DNA抗體及甲狀腺球蛋白抗體，紅斑性痕瘡抗體等等；在衛(wèi)生學(xué)方面，可用于檢測(cè)食品中葡萄球菌腸毒素及沙門(mén)氏菌毒素等等。 免疫印跡（ western blot） 印跡法（ blotting）是指將樣品轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用相應(yīng)的探測(cè)反應(yīng)來(lái)檢測(cè)樣品的一種方法 。 1975年， Southern建立了將 DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（ NC膜）上，并利用 DNA－ DNA雜交檢測(cè)特定的 DNA片段的方法，稱(chēng)為Southern印跡法。 而后人們用類(lèi)似的方法，對(duì) RNA和蛋白質(zhì)進(jìn)行印跡分析，對(duì) RNA的印跡分析稱(chēng)為 Northern印跡法，對(duì)單向電泳后的蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為 Western印跡法，對(duì)雙向電泳后蛋白質(zhì)分子的印跡分析稱(chēng)為Eastern印跡法。 埃德溫 邁勒 薩瑟恩 （ Edwin Mellor Southern） 基本原理 應(yīng)用范圍 ? 檢測(cè)組織、細(xì)胞中蛋白的表達(dá)情況（定性、半定量） 底物溶液，當(dāng)二抗上的酶催化底物產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光時(shí) ,用 X光片曝光，洗片后就會(huì)產(chǎn)生可見(jiàn)的區(qū)帶，指示目的蛋白質(zhì)的位置和強(qiáng)弱。 品分開(kāi)。 （如 5％的脫脂奶粉）處理以封閉固相載體上剩余的疏水結(jié)合位點(diǎn)，而后用目的蛋白的抗血清（一抗）孵育，印跡中只有目的蛋白質(zhì)與一抗特異性結(jié)合。洗去游離的一抗后，用再與酶標(biāo)記的二抗孵育 白從凝膠轉(zhuǎn)移至一種固相支持體 .轉(zhuǎn)移后的硝酸纖維素膜就稱(chēng)為一個(gè)印跡（ blot），用于對(duì)蛋白質(zhì)的進(jìn)一步檢測(cè)。 或組織蛋白，測(cè)定總蛋白濃度 度，并處理樣品 基本步驟 細(xì)胞總蛋白的提取 ? 提取細(xì)胞蛋白多是利用將細(xì)胞裂解、破碎、使蛋白質(zhì)釋放的原理。提取蛋白質(zhì)的方法很多， 鑒于后續(xù)實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白性質(zhì)的要求不同，因此很難找到一種萬(wàn)能的裂解方法。 ? 不論采用那種方法，都應(yīng)遵循以下原則： 1．盡可能采用簡(jiǎn)單方法進(jìn)行樣品處理，以避免蛋白丟失。 2．細(xì)胞和組織樣品的制備應(yīng)盡可能減少蛋白的降解，低溫和蛋白酶抑制劑可以減少蛋白的降解，蛋白酶抑制劑的種類(lèi)很多，要根據(jù)具體情況具體選擇。本實(shí)驗(yàn)中選用 PMSF(苯甲基磺酰氟 )作為蛋白酶抑制劑。 3．樣品裂解液應(yīng)