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正文內(nèi)容

臨床免疫學(xué)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作程序sop資料(編輯修改稿)

2024-08-11 22:06 本頁(yè)面
 

【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 水并調(diào)零,于490nm處每隔30分鐘測(cè)一次,觀察各個(gè)通道4小時(shí)內(nèi)吸光度的變化。:每個(gè)通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解,蒸餾水調(diào)零,于490nm作雙份平行測(cè)定,每日測(cè)二次(上下午各一次),連續(xù)測(cè)定20天。分別計(jì)算其批內(nèi)精密度,日內(nèi)批精密度,日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV值。:用電子天平精確稱取甲基橙配制5個(gè)系列的溶液,于490nm平行測(cè)8次,取其均值。計(jì)算其回歸方程,相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)估計(jì)誤差s,并用177。:取一分甲基橙溶液,分別加入3種不同濃度的溶血液(測(cè)定波長(zhǎng)為490nm,校正波長(zhǎng)為585nm),先后于8個(gè)通道檢測(cè),每個(gè)通道測(cè)3次,比較各組之間是否具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,以考察雙波長(zhǎng)消除干擾組分的效果。【標(biāo)本的采集和保存】,因紅細(xì)胞破裂可釋放過(guò)氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果,以HRP為標(biāo)記的ELISA測(cè)定中,溶血標(biāo)本會(huì)增加非特異性顯色造成假陽(yáng)性。,因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性反應(yīng)。,建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。,使間接法的試劑本底加深,一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測(cè)試。如需保存一周以上則要20℃冰凍保存,凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,融解時(shí)應(yīng)上下顛倒充分混勻,同時(shí)避免氣泡。可上下顛倒混和,不要在混勻器上強(qiáng)烈振蕩。反復(fù)凍融會(huì)使抗體效價(jià)跌落,如需保存作多次檢測(cè),宜少量分裝冰存。5. ELISA的靈敏度1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免,尤其不應(yīng)與生化試驗(yàn)用同一管標(biāo)本。 【分析中質(zhì)控】ELISA實(shí)驗(yàn)的結(jié)果受操作影響很大,每個(gè)步驟包括加樣,溫育,洗滌,顯色,酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認(rèn)真負(fù)責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏,強(qiáng)特異的優(yōu)點(diǎn)。因此,應(yīng)建立實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(SOP)。1. 加樣[1] 加樣應(yīng)用微量移液器(加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板底部,避免加在孔壁上部,不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。[2] 每次加樣應(yīng)更換吸嘴,做到一人一吸頭,以免發(fā)生交叉污染。干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。[3] 樣本稀釋,目的是為了減少非特異性反應(yīng),所以一定要先加稀釋液后加樣本,特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘,同時(shí)注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時(shí)均需振蕩混勻。[4] 如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2. 溫育[1] 抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下(37176。C),經(jīng)過(guò)一定的時(shí)間才能達(dá)到反應(yīng)的平衡點(diǎn)[2] ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達(dá)到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。[3] 反應(yīng)板不宜疊放,注意溫育的溫度和時(shí)間應(yīng)按規(guī)定控制,一個(gè)人操作時(shí),一次不宜多于兩塊板同時(shí)測(cè)定。 3. 洗滌[1] 手工洗滌一般采用浸泡方法:1)甩去孔內(nèi)反應(yīng)液; 2)用洗滌液過(guò)洗一遍(即注滿孔后即甩去);3)微孔重新注滿洗液后浸泡23分鐘,間歇搖動(dòng);4)甩去孔內(nèi)液體,拍板,用紙吸干。重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。[2] 洗板機(jī)洗板一定要預(yù)先把板架放平,使洗板機(jī)上的每個(gè)放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底,將孔內(nèi)液體全部吸干,同時(shí)要設(shè)置一定的浸泡時(shí)間。如出現(xiàn)機(jī)洗后拍板有較多殘留液時(shí)應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機(jī)前要用蒸溜水沖洗管道,避免堵孔。4. 顯色[1] HRP催化底物的一步呈色反應(yīng),同樣需要一定的時(shí)間和溫度,[2] 一定要按照說(shuō)明書規(guī)定的時(shí)間溫度(一般為37176。C,1015分鐘)恒定反應(yīng)后終止[3] .5. 酶標(biāo)儀判讀結(jié)果(30分鐘內(nèi))。,以后者最為常見,而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色,測(cè)定波長(zhǎng)為490nm;TMB終止后顯黃色,測(cè)定波長(zhǎng)為450nm,二種底物的校正波長(zhǎng)均用630nm。同時(shí)要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色,否則吸光度易出現(xiàn)負(fù)值或損壞濾光片。【分析后質(zhì)控】【報(bào)告方式】:國(guó)內(nèi)外為便于統(tǒng)一計(jì)算,一律按S/COV方式報(bào)告,S為標(biāo)本A值,COV即Cut Off值(或COV)[1] 夾心法和間接法以S/COV≥1為陽(yáng)性;競(jìng)爭(zhēng)法與中和法以S/COV﹤1為陽(yáng)性[2] COV的計(jì)算公式以試劑盒說(shuō)明書的為準(zhǔn)常見的有:A) COV=N(),此公式由P/N,常用于夾心法。B) COV=N,從抑止率公式換算而來(lái),常用于競(jìng)爭(zhēng),中和法。C) COV=N+C(C為常數(shù)),用于間接法。D) COV=CP+N(C為常數(shù)),用于間接法。此公式最客觀,但對(duì)廠家要求很高,陰陽(yáng)性對(duì)照測(cè)定值要基本恒定。:嚴(yán)禁用定性試劑盒做定量分析。[1] 用已知量的系列標(biāo)準(zhǔn)品,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,結(jié)果以絕對(duì)量或單位表示。ELISA的標(biāo)準(zhǔn)曲線每次都要和待測(cè)標(biāo)本做在同一塊板上。[2] 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準(zhǔn)曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線,要得到精確的結(jié)果實(shí)屬不易?!居涗洝?[1] 所有實(shí)驗(yàn)的原始資料均應(yīng)存檔;所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊(cè);原始登記表應(yīng)記錄試劑來(lái)源、批號(hào);質(zhì)控血清的來(lái)源及測(cè)定值并注明是否在控;簽上實(shí)驗(yàn)者姓名及審核者姓名。[2] 如試驗(yàn)結(jié)果對(duì)臨床診斷有決定意義,其樣本應(yīng)保留,至少與病歷保存期一致【定性試驗(yàn)】ELISA定性試驗(yàn)的臨床意義在于是否檢出病原體,與檢出量無(wú)關(guān),因此QC要保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無(wú)法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法:將試劑盒所設(shè)的陰陽(yáng)性對(duì)照作為內(nèi)對(duì)照指示反應(yīng);另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清,正常人血清作為外對(duì)照,與標(biāo)本同時(shí)檢測(cè),臨界值S/≥1,高值質(zhì)控血清S/≥10,~。陽(yáng)性質(zhì)控血清失控(臨界值為靈敏度,高值為HOOK效應(yīng)監(jiān)控)應(yīng)重做陰性標(biāo)本;陰性對(duì)照失控應(yīng)重做陽(yáng)性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果,作為QC資料存檔。【定量試驗(yàn)】ELISA定量試驗(yàn)常見于腫瘤因子(如AFP,CEA,CA系列),激素類,免疫球蛋白類,這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量(正常范圍),超出這個(gè)量才呈病理情況,故需定量測(cè)定。定量試驗(yàn)的質(zhì)控方法可參考生化方式。 【即刻性質(zhì)控】在開始進(jìn)行質(zhì)控時(shí),只需要有3個(gè)質(zhì)控血清測(cè)定值即可進(jìn)行質(zhì)控。當(dāng)這組數(shù)據(jù)擴(kuò)大到20次有效值時(shí)就可以計(jì)算RCV的X,s。方法:1. 先將測(cè)定值從小到大排列,X1最小,Xn最大;;。SI上=(X最小X)/S, SI下=(X最大X)/S,檢查是否出控,SI上、下限≤規(guī)定值,在控;SI上或下限規(guī)定值,失控。操作人員 部門主管 質(zhì)量負(fù)責(zé)人姓名 ****** ****** ****** 日期 **年**月**日 Ⅵ 免疫學(xué)檢驗(yàn)室間質(zhì)量評(píng)價(jià)的標(biāo)準(zhǔn)操作程序(EQA)實(shí)驗(yàn)室名稱項(xiàng)目編號(hào)制定日期******ELISA方法********年**月**日【目的】采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評(píng)價(jià)各實(shí)驗(yàn)室的試驗(yàn)結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準(zhǔn)確性,了解各實(shí)驗(yàn)室之間結(jié)果的差異,并幫助校正,使具有可比性?!驹揝OP變動(dòng)程序】本標(biāo)準(zhǔn)操作程序的變動(dòng),可由任一使用本SOP的工作人員提出,并報(bào)經(jīng)下述人員批準(zhǔn)簽字:專業(yè)主管、科主任?!净靖拍睢俊举|(zhì)量控制】是監(jiān)視ELISA操作全過(guò)程,排除誤差,維持標(biāo)準(zhǔn)化操作的一個(gè)管理過(guò)程。這一過(guò)程是通過(guò)一個(gè)反饋環(huán)路進(jìn)行的:;(預(yù)期值);;;,并說(shuō)明原因。超出預(yù)定誤差范圍,報(bào)警系發(fā)出信號(hào),反饋通道中斷。,解決差異?;謴?fù)原狀(原標(biāo)準(zhǔn)狀態(tài))的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進(jìn)行。質(zhì)控圖是把某一檢驗(yàn)的性能數(shù)據(jù)與所計(jì)算出來(lái)的預(yù)期的控制限進(jìn)行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進(jìn)行時(shí),按時(shí)間順序而抽選出來(lái)的,其目的是檢測(cè)檢驗(yàn)過(guò)程中變異的可追查性原因??勺纺嫘缘恼`
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