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正文內(nèi)容

臨床免疫學(xué)檢驗標(biāo)準操作程序sop資料(編輯修改稿)

2024-08-11 22:06 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 水并調(diào)零,于490nm處每隔30分鐘測一次,觀察各個通道4小時內(nèi)吸光度的變化。:每個通道3只小杯分別加入200ul高中低3種不同濃度的甲基橙溶解,蒸餾水調(diào)零,于490nm作雙份平行測定,每日測二次(上下午各一次),連續(xù)測定20天。分別計算其批內(nèi)精密度,日內(nèi)批精密度,日間精密度和總精密度及相應(yīng)的CV值。:用電子天平精確稱取甲基橙配制5個系列的溶液,于490nm平行測8次,取其均值。計算其回歸方程,相關(guān)系數(shù)及標(biāo)準估計誤差s,并用177。:取一分甲基橙溶液,分別加入3種不同濃度的溶血液(測定波長為490nm,校正波長為585nm),先后于8個通道檢測,每個通道測3次,比較各組之間是否具有統(tǒng)計學(xué)差異,以考察雙波長消除干擾組分的效果?!緲?biāo)本的采集和保存】,因紅細胞破裂可釋放過氧化物酶活性物質(zhì)干擾立可讀方法的結(jié)果,以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,溶血標(biāo)本會增加非特異性顯色造成假陽性。,因菌體中可能含有內(nèi)源性HRP也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。,建議盡量不用抗凝血尤其是不使用用肝素抗凝劑。,使間接法的試劑本底加深,一般血清置4℃冰箱5天內(nèi)完成測試。如需保存一周以上則要20℃冰凍保存,凍結(jié)血清融解后,蛋白質(zhì)局部濃縮,分布不均,融解時應(yīng)上下顛倒充分混勻,同時避免氣泡。可上下顛倒混和,不要在混勻器上強烈振蕩。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落,如需保存作多次檢測,宜少量分裝冰存。5. ELISA的靈敏度1ng/ml水平上,標(biāo)本間的污染要盡量避免,尤其不應(yīng)與生化試驗用同一管標(biāo)本。 【分析中質(zhì)控】ELISA實驗的結(jié)果受操作影響很大,每個步驟包括加樣,溫育,洗滌,顯色,酶標(biāo)儀讀數(shù)均應(yīng)認真負責(zé)才能充分發(fā)揮ELISA的高靈敏,強特異的優(yōu)點。因此,應(yīng)建立實驗項目的標(biāo)準操作程序(SOP)。1. 加樣[1] 加樣應(yīng)用微量移液器(加樣槍)按規(guī)定的量加入微孔板底部,避免加在孔壁上部,不可濺出,不可產(chǎn)生氣泡。[2] 每次加樣應(yīng)更換吸嘴,做到一人一吸頭,以免發(fā)生交叉污染。干吸頭預(yù)先在血清中抽吸三次。[3] 樣本稀釋,目的是為了減少非特異性反應(yīng),所以一定要先加稀釋液后加樣本,特別注意加樣后要在微量振蕩器上振蕩30秒鐘,同時注意防止液體溢出。如后面操作步驟中加二種以上試劑時均需振蕩混勻。[4] 如用滴瓶滴加試劑應(yīng)先將滴瓶搖勻并擠去第一滴有氣泡的試劑后加樣。2. 溫育[1] 抗原抗體反應(yīng)需要在一定溫度下(37176。C),經(jīng)過一定的時間才能達到反應(yīng)的平衡點[2] ELISA邊緣效應(yīng)是由溫育形成的。所以溫育一般采用能使反應(yīng)液溫度迅速達到平衡的水浴法。水要浸至板條的1/3處。[3] 反應(yīng)板不宜疊放,注意溫育的溫度和時間應(yīng)按規(guī)定控制,一個人操作時,一次不宜多于兩塊板同時測定。 3. 洗滌[1] 手工洗滌一般采用浸泡方法:1)甩去孔內(nèi)反應(yīng)液; 2)用洗滌液過洗一遍(即注滿孔后即甩去);3)微孔重新注滿洗液后浸泡23分鐘,間歇搖動;4)甩去孔內(nèi)液體,拍板,用紙吸干。重復(fù)以上操作至少5次。注意各種試劑盒的洗滌液盡量不要混用。[2] 洗板機洗板一定要預(yù)先把板架放平,使洗板機上的每個放液和吸液纖孔都能一致地插入孔底,將孔內(nèi)液體全部吸干,同時要設(shè)置一定的浸泡時間。如出現(xiàn)機洗后拍板有較多殘留液時應(yīng)再用手工洗2次以上。關(guān)機前要用蒸溜水沖洗管道,避免堵孔。4. 顯色[1] HRP催化底物的一步呈色反應(yīng),同樣需要一定的時間和溫度,[2] 一定要按照說明書規(guī)定的時間溫度(一般為37176。C,1015分鐘)恒定反應(yīng)后終止[3] .5. 酶標(biāo)儀判讀結(jié)果(30分鐘內(nèi))。,以后者最為常見,而TMB酸不易終止因此必須盡快比色以免影響結(jié)果。OPD終止后顯棕色,測定波長為490nm;TMB終止后顯黃色,測定波長為450nm,二種底物的校正波長均用630nm。同時要注意反應(yīng)板應(yīng)用紙吸干后才能置酶標(biāo)儀中比色,否則吸光度易出現(xiàn)負值或損壞濾光片?!痉治龊筚|(zhì)控】【報告方式】:國內(nèi)外為便于統(tǒng)一計算,一律按S/COV方式報告,S為標(biāo)本A值,COV即Cut Off值(或COV)[1] 夾心法和間接法以S/COV≥1為陽性;競爭法與中和法以S/COV﹤1為陽性[2] COV的計算公式以試劑盒說明書的為準常見的有:A) COV=N(),此公式由P/N,常用于夾心法。B) COV=N,從抑止率公式換算而來,常用于競爭,中和法。C) COV=N+C(C為常數(shù)),用于間接法。D) COV=CP+N(C為常數(shù)),用于間接法。此公式最客觀,但對廠家要求很高,陰陽性對照測定值要基本恒定。:嚴禁用定性試劑盒做定量分析。[1] 用已知量的系列標(biāo)準品,繪制標(biāo)準曲線,結(jié)果以絕對量或單位表示。ELISA的標(biāo)準曲線每次都要和待測標(biāo)本做在同一塊板上。[2] 現(xiàn)有的ELISA定量試劑盒標(biāo)準曲線只有在較窄的濃度范圍內(nèi)成直線,要得到精確的結(jié)果實屬不易?!居涗洝?[1] 所有實驗的原始資料均應(yīng)存檔;所有的記錄均應(yīng)規(guī)范登記在冊;原始登記表應(yīng)記錄試劑來源、批號;質(zhì)控血清的來源及測定值并注明是否在控;簽上實驗者姓名及審核者姓名。[2] 如試驗結(jié)果對臨床診斷有決定意義,其樣本應(yīng)保留,至少與病歷保存期一致【定性試驗】ELISA定性試驗的臨床意義在于是否檢出病原體,與檢出量無關(guān),因此QC要保證試驗的靈敏度和特異性。生化的質(zhì)控圖方法僅能觀察靈敏度而無法監(jiān)控特異性。建議使用臨界值血清界定法:將試劑盒所設(shè)的陰陽性對照作為內(nèi)對照指示反應(yīng);另設(shè)臨界值、高值質(zhì)控血清,正常人血清作為外對照,與標(biāo)本同時檢測,臨界值S/≥1,高值質(zhì)控血清S/≥10,~。陽性質(zhì)控血清失控(臨界值為靈敏度,高值為HOOK效應(yīng)監(jiān)控)應(yīng)重做陰性標(biāo)本;陰性對照失控應(yīng)重做陽性標(biāo)本。以表格式記錄每塊板的外對照實驗結(jié)果,作為QC資料存檔。【定量試驗】ELISA定量試驗常見于腫瘤因子(如AFP,CEA,CA系列),激素類,免疫球蛋白類,這些物質(zhì)在體內(nèi)有一定的量(正常范圍),超出這個量才呈病理情況,故需定量測定。定量試驗的質(zhì)控方法可參考生化方式。 【即刻性質(zhì)控】在開始進行質(zhì)控時,只需要有3個質(zhì)控血清測定值即可進行質(zhì)控。當(dāng)這組數(shù)據(jù)擴大到20次有效值時就可以計算RCV的X,s。方法:1. 先將測定值從小到大排列,X1最小,Xn最大;;。SI上=(X最小X)/S, SI下=(X最大X)/S,檢查是否出控,SI上、下限≤規(guī)定值,在控;SI上或下限規(guī)定值,失控。操作人員 部門主管 質(zhì)量負責(zé)人姓名 ****** ****** ****** 日期 **年**月**日 Ⅵ 免疫學(xué)檢驗室間質(zhì)量評價的標(biāo)準操作程序(EQA)實驗室名稱項目編號制定日期******ELISA方法********年**月**日【目的】采用一系列的辦法連續(xù)地、客觀地評價各實驗室的試驗結(jié)果,并發(fā)現(xiàn)室內(nèi)質(zhì)控不易發(fā)現(xiàn)的不準確性,了解各實驗室之間結(jié)果的差異,并幫助校正,使具有可比性?!驹揝OP變動程序】本標(biāo)準操作程序的變動,可由任一使用本SOP的工作人員提出,并報經(jīng)下述人員批準簽字:專業(yè)主管、科主任?!净靖拍睢俊举|(zhì)量控制】是監(jiān)視ELISA操作全過程,排除誤差,維持標(biāo)準化操作的一個管理過程。這一過程是通過一個反饋環(huán)路進行的:;(預(yù)期值);;;,并說明原因。超出預(yù)定誤差范圍,報警系發(fā)出信號,反饋通道中斷。,解決差異。恢復(fù)原狀(原標(biāo)準狀態(tài))的手段發(fā)揮作用。質(zhì)量控制主要采用質(zhì)控圖進行。質(zhì)控圖是把某一檢驗的性能數(shù)據(jù)與所計算出來的預(yù)期的控制限進行比較的圖。這種性能數(shù)據(jù)是在按規(guī)程正常進行時,按時間順序而抽選出來的,其目的是檢測檢驗過程中變異的可追查性原因??勺纺嫘缘恼`
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