【文章內容簡介】 素： 溶液中SDS單體的濃度 樣品緩沖液的離子強度 二硫鍵是否完全被還原SDS聚丙烯酰氨凝膠的組成與聚合 凝膠分為均勻膠和梯度膠兩種.。梯度膠可提高蛋白質分子量的分離范圍：10%15%適合于125萬MW配膠時：1丙烯酰胺的質量2盡量減少AP，TEMED的量.3 控制聚合時間（4060分鐘）溫度3050度 4 室溫放置12小時樣品的制備： 樣品緩沖液的組成：甘油，溴酚藍，還原劑（DTT），SDS，TRISHCL樣品處理：加熱變性特殊樣品的處理： 上樣濃度：考馬斯亮藍染色：20~30納克/微升 銀染： ~分子量測定： 標準蛋白:蛋白標準的結構與行為盡可能與待測樣品接近，分子量范圍略高和低于未知蛋白 相同的條件和方法制備樣品和標準品，然后在分離和混合狀態(tài)下一起電泳（在同一張電泳板上） 相對遷移率=蛋白遷移的距離/溴酚藍遷移的距離。 LogMW=bmR+K SDS電泳測定分子量的局限性： 測得分子量為亞基的分子量. 不適合于電荷異?；蚪Y構異常蛋白.實驗程序： 配膠 電泳 染色 脫色 掃描低分子量多肽的SDS電泳：常規(guī)PAGE電泳不適合分離15KD以下多肽SDS多肽膠束大致是球形，長度和直徑在同一個數量級 較高的內部電荷不能被覆蓋 解決辦法：1增加膠聯度 2加入尿素 3增加緩沖液的濃度，慢離子改為TRICINE，可使電泳的適用范圍：1100KD第四節(jié) 等電聚焦技術 Isoelectric focusing(IEF): 利用蛋白質分子或其它兩性分子的等電點不同，在一個穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的PH梯度中進行分離分析的一項技術 適用樣品為：蛋白質和其他兩性分子 原 理： 等電聚焦的濃縮效應 PH梯度形成過程第五節(jié) 雙向電泳第一向：等電聚焦電泳 第二向：SDSPAGE雙向電泳后的凝膠經染色后蛋白呈現二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異 垂直方向反映出它們在分子量上的差別 第六節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負電荷，在外加電場作用下向正極泳動。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動時，有電荷效應與分子篩效應。不同DNA的分子量大小及構型不同，電泳時的泳動率就不同，從而分出不同的區(qū)帶染色：溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EBDNA復合物，其熒光強度與DNA的含量成正比。根據熒光強度可粗略估計樣品DNA濃度 。 第四章 免疫分析法免疫分析法 利用抗原抗體反應檢測各種物質（藥物、激素、蛋白質、微生物等）的方法分類：1非標記的免疫分析法： 免疫擴散、免疫電泳2標記的免疫分析法：1）酶聯免疫分析 2）放射免疫分析 3）其它免疫分析法（熒光免疫技術、膠體金免疫技術、發(fā)光免疫技術和鐵蛋白免疫技術等）一、免疫擴散技術Immunodiffusion基本原理：可溶性的抗原和相應的抗體在溶液或凝膠中彼此接觸，形成不溶性抗原抗體復合物沉淀 應用： 已知的抗原檢查相應的抗體 已知的抗體檢查相應的抗原1. 單向免疫擴散 (Single immunodiffusion)基本原理：指抗原和抗體兩種成分中只有一種擴散，另一種被固定在凝膠中 本法常用于測定血清IgG、IgM、IgA 和 C3等的含量 2. 雙向免疫擴散 （Double immunodiffusion)基本原理：指可溶性抗原與相應抗體在瓊脂介質中相互擴散，彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。如果反應體系中含兩種以上的抗原抗體系統，則小孔間可出現兩條以上的沉淀線。【實驗方法】制板：潔凈的玻片，%瓊脂鋪滿整個玻片，待凝打孔：按下圖3mm直徑的小孔，孔距5mm加樣：微量進樣器從低濃度到高濃度加抗原入外圍孔中，中間孔加抗體保溫擴散：28 ℃或37 ℃靜置24h取出瓊脂板，觀察結果 雙向免疫擴散的適用對象：抗原、抗體相對含量測定；抗原、抗體相對分子量分析二、免疫電泳技術（Immunoelectrophoresis)基本原理：免疫擴散與電泳技術相結合。類型：對流免疫電泳 火箭免疫電離 免疫電泳 雙向免疫電泳（交叉免疫電泳）1. 對流免疫電泳Counter immunoelectrophoresis 基本原理：多數蛋白質抗原在堿性緩沖液中帶負電荷，在電泳時從負極向正極移動。抗體屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負電荷，而且相對分子質量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負極移動。這樣就使抗原和抗體定向對流，在兩孔間相遇時發(fā)生反應，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線 【實驗方法】1制板 2 打孔3加樣:將抗原加入瓊脂糖板上有標記孔側的小孔中，抗體加入另一側小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)4 電泳:將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側置陰極端，抗體孔側置陽極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6～10 V/cm板長，電泳約30～60 min。關閉電源，取出瓊脂板，觀察結果。 2. 火箭免疫電泳（Rocket immunoelectrophoresis)基本原理：也稱免疫擴散，抗原在含有定量抗體的瓊脂糖中泳動，兩者比例適宜時，在較短時間內生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。3. 免疫電泳基本原理：是先將待側樣本作瓊脂凝膠電泳，各蛋白抗原組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴散，在各區(qū)帶相應的位置形成沉淀弧。免疫電泳技術的用途:對流免疫電泳——快速、半定量測定火箭免疫電泳——快速、定量測定免疫電泳——抗原分析（該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失）三、酶聯免疫分析技術基本原理 :酶標記抗體或酶標記抗體進行的抗原抗體反應采用抗原與抗體的特異反應與酶連接，然后通過酶與底物產生顏色反應，用于定量測定 第五章 色譜分析法 第一節(jié) 一、色譜法的定義定義：色譜法 (chromatography)，是一種物理或物理化學的分離分析方法 原理：利用物質在固定相和流動相中的分配系數不同，使混合物中的各組分分離離 《中國藥典》2005版:一部收載中藥1146個品種，用薄層色譜進行鑒別或含量測定的有1523項，用高效液相色譜進行定量分析的有479種518項，用氣相色譜進行檢測的有47種二部收載的有1967個品種，采用高效液相色譜法的品種有848種二、色譜法的起源 1．創(chuàng)立：1906年，俄國植物學家Tsweet 植物色素分離 2．現狀：一種重要的分離、分析技術分離混合物各組分并加以分析,還可以進行制備: 固定相——除了固體，還可以是液體 流動相——液體或氣體 色譜柱——各種材質和尺寸 被分離組分——不再僅局限于有色物質三、色譜法的特點優(yōu)點：“三高”、“一快”、“一廣” 高選擇性、高效能 、高靈敏度、分析速度快、應用范圍廣缺點： 對未知物分析的定性專屬性差 需要與其他分析方法聯用(GCMS,LCMS)四、色譜法的分類2．按固定相的固定方式分類第二節(jié) 色譜過程和基本原理一、色譜過程、分離原理㈠色譜過程 指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過程以吸附色譜為例： 吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反復多次洗脫→被測組分分配系數 不同→差速遷移→ 分離㈡色譜分離原理： 色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異二、色譜流出曲線㈠色譜流出曲線和色譜峰（二）色譜峰高和峰面積：指組分在柱后出現濃度極大時的檢測信號，即色譜峰頂至基線的距離：指色譜曲線與基線間包圍的面積第三節(jié) 色譜法的基本類型 根據色譜法的作用機制分四種：1分配色譜法 2吸附色譜法 3離子交換色譜法 4空間排阻色譜法一、分配色譜法分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動相中的溶解度差別所造成的分配系數差別而被分離要求：固定相→機械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強極性溶劑 載 體→惰性物質，無吸附性性質穩(wěn)定，不與固定相和流動相發(fā)生化學反應常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等 流動相→必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等 二、吸附色譜法 各組分與流動相分子爭奪吸附劑表面活性中心,、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離（1）對吸附劑的要求 ①有大的表面積和足夠的吸附能力 ②對不同的化學成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開 ③與流動相、溶劑及樣品中各成分不起化學反應 ④在所用的溶劑及流動相中不溶解 ⑤顆粒均勻，操作過程中不會碎裂 （2）吸附劑的類別①有機類 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等②無機類 氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、 硅藻土等要求 ①應使用較純試劑，含雜質會影響洗脫能力 ②與樣品或吸附劑不發(fā)生化學反應 ③能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值 ④粘度小，易流動 三、離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機物或無機物圖示分離機制：依據被測組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實現分離 固定相是離子交換劑 ——常見的是離子交換樹脂，是具有網狀立體結構高分子的聚合物 流動相——水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫呋喃、乙腈等有機溶劑，提高選擇性（四）空間排阻色譜法要求： 固定相→多孔性凝膠 流動相→水——凝膠過濾色譜 流動相→有機溶劑——凝膠滲透色譜 分離機制見圖示分離機制：利用被測組分分子大小不同、在固定相上選擇性 滲透實現分離2．固定相和流動相固定相 多孔凝膠流動相 要選對樣品的溶解好，又能潤濕凝膠粘度要低的溶劑，否則，會限制分子擴散而影響分離效果一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機溶劑 第六章 生物檢定法 第一節(jié)、生物檢定法概述一、生物檢定涵義生物檢定是利用生物體包括整體動物、離體組織/器官、細胞和微生物等評估藥物生物活性的一種方法 以藥物的藥理作用為基礎，以生物統計為工具，運用特定的實驗設計在一定條件下比較供試品和相當的標準品或對照品所產生的特定反應，通過等反應劑量間比例的運算或限值劑量引起的生物反應程度，從而測定供試品的效價、生物活性或雜質引起的毒性 標準品管理：我國目前生物檢定所用標準品主要來源于中國藥品生物制品檢定所、衛(wèi)生部臨床檢驗中心和WHO的生物標準品實驗室(如NIBSC)，或通過NIBSC網站( //)訂購所需要的國際生物標準品 實驗室拿到國家標準品或國際標準品后，可以制備自己的工作標準品。應定期對工作標準品進行檢測和效價測定，并對效價測定結果進行趨勢分析 應特別注意工作標準品的使用效期和儲存條件 二、生物檢定類型按生物體分類：體內測定 (in vivo)整體動物體外測定(in vitro)離體器官、組織，微生物和細胞（原代細胞、傳代細胞）按標準品與供試品異同分類：分析稀釋檢定(analytical dilution assay)S與T為相同物質，僅濃度或含量不等 比較稀釋檢定(parative dilution assay)S與T為不同物質，但在一定劑量范圍內有相同生物反應 三、生物反應類型量反應藥物對生物體所引起的反應是可以計量大小的。時反應也屬于量反應范疇，是觀察某一種反應出現所需要的時間 質反應當一定劑量的藥物注入動物體內后，觀察某一反應或反應的某一程度出現與否，只有質的變化。此類反應只用反應率而不能用量來表示個體的反應程度 四、生物檢定的作用（一）工藝與方法驗證對于新生產工藝、新檢測方法的改進、變更，往往需要生物檢定來驗證核對。生物檢定可監(jiān)測不曾預料、不易發(fā)現的構象變化，它是所有變化的綜合效應 藥典（BP、ChP）規(guī)定在重組人生長激素(rhGH)、重組人胰高血糖素質量標準中明確規(guī)定，在生產研發(fā)階段，“生產過程中的產品必須用體內生物檢定方法測定其生物效價”，直到生產穩(wěn)定為止 當采用理化方法測定[如HPLC]替代rhGH、胰島素、人胰高血糖素、降鈣素等原有的生物效價測定法時，仍需作大量的方法比對、相關性研究等工作，生物檢定是驗證的主要標尺 （二） 效價與活性1. 定量測定效價(potency)測定是生物檢定的主要內容，它以藥理為基礎，生物統計為工具，運用特定的實驗設計，利用生物體在一定條件下比較供試品與相當的標準品或對照品所產生的特定反應(可測定、量化的生理指標或生物學特性的變化)，來測定藥物生物活性(藥效或毒力)的一種定量的方法，因而被稱為定量藥理學 整體動物的體內測定法，能反映藥物對人體作用方式，是最經典的生物檢定法，因此rhGH等工藝驗證要求必須用體內生物檢定方法 載入《中國藥典》(ChP)2005年版二部對生化藥物的效價測定有21個品種，約占生化藥總數的10%，其中應用體內測定法的有蛋白質、肽類激素等 體外生物檢定法包括離體動物器官測定法、細胞培養(yǎng)(促進細胞生長、抑制細胞生長、間接保護細胞)測定法、生化酶促反應測定法、免疫學活性測定法(已進展為基于抗原抗體反應，免疫化學與使用儀器相結合的高效、便捷方法)等基因重組技術產品的活性測定多采用相對快速、重復性好的體外測定的細胞培養(yǎng)測定法 雖然某些情況下體外生物檢定