【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 素： 溶液中SDS單體的濃度 樣品緩沖液的離子強(qiáng)度 二硫鍵是否完全被還原SDS聚丙烯酰氨凝膠的組成與聚合 凝膠分為均勻膠和梯度膠兩種.。梯度膠可提高蛋白質(zhì)分子量的分離范圍：10%15%適合于125萬(wàn)MW配膠時(shí)：1丙烯酰胺的質(zhì)量2盡量減少AP，TEMED的量.3 控制聚合時(shí)間（4060分鐘）溫度3050度 4 室溫放置12小時(shí)樣品的制備： 樣品緩沖液的組成：甘油，溴酚藍(lán)，還原劑（DTT），SDS，TRISHCL樣品處理：加熱變性特殊樣品的處理： 上樣濃度：考馬斯亮藍(lán)染色：20~30納克/微升 銀染： ~分子量測(cè)定： 標(biāo)準(zhǔn)蛋白:蛋白標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)構(gòu)與行為盡可能與待測(cè)樣品接近，分子量范圍略高和低于未知蛋白 相同的條件和方法制備樣品和標(biāo)準(zhǔn)品，然后在分離和混合狀態(tài)下一起電泳（在同一張電泳板上） 相對(duì)遷移率=蛋白遷移的距離/溴酚藍(lán)遷移的距離。 LogMW=bmR+K SDS電泳測(cè)定分子量的局限性： 測(cè)得分子量為亞基的分子量. 不適合于電荷異常或結(jié)構(gòu)異常蛋白.實(shí)驗(yàn)程序： 配膠 電泳 染色 脫色 掃描低分子量多肽的SDS電泳：常規(guī)PAGE電泳不適合分離15KD以下多肽SDS多肽膠束大致是球形，長(zhǎng)度和直徑在同一個(gè)數(shù)量級(jí) 較高的內(nèi)部電荷不能被覆蓋 解決辦法：1增加膠聯(lián)度 2加入尿素 3增加緩沖液的濃度，慢離子改為TRICINE，可使電泳的適用范圍：1100KD第四節(jié) 等電聚焦技術(shù) Isoelectric focusing(IEF): 利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定的、連續(xù)的、線性的PH梯度中進(jìn)行分離分析的一項(xiàng)技術(shù) 適用樣品為：蛋白質(zhì)和其他兩性分子 原 理： 等電聚焦的濃縮效應(yīng) PH梯度形成過(guò)程第五節(jié) 雙向電泳第一向：等電聚焦電泳 第二向：SDSPAGE雙向電泳后的凝膠經(jīng)染色后蛋白呈現(xiàn)二維分布圖：水平方向反映出蛋白在pI上的差異 垂直方向反映出它們?cè)诜肿恿可系牟顒e 第六節(jié) 瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖是一種天然聚合長(zhǎng)鏈狀分子，可以形成具有剛性的濾孔，凝膠孔徑的大小決定于瓊脂糖的濃度。DNA分子在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在外加電場(chǎng)作用下向正極泳動(dòng)。DNA分子在瓊脂糖凝膠中泳動(dòng)時(shí)，有電荷效應(yīng)與分子篩效應(yīng)。不同DNA的分子量大小及構(gòu)型不同，電泳時(shí)的泳動(dòng)率就不同，從而分出不同的區(qū)帶染色：溴化乙錠（EB）為扁平狀分子，在紫外光照射下發(fā)射熒光。EB可與DNA分子形成EBDNA復(fù)合物，其熒光強(qiáng)度與DNA的含量成正比。根據(jù)熒光強(qiáng)度可粗略估計(jì)樣品DNA濃度 。 第四章 免疫分析法免疫分析法 利用抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)各種物質(zhì)（藥物、激素、蛋白質(zhì)、微生物等）的方法分類：1非標(biāo)記的免疫分析法： 免疫擴(kuò)散、免疫電泳2標(biāo)記的免疫分析法：1）酶聯(lián)免疫分析 2）放射免疫分析 3）其它免疫分析法（熒光免疫技術(shù)、膠體金免疫技術(shù)、發(fā)光免疫技術(shù)和鐵蛋白免疫技術(shù)等）一、免疫擴(kuò)散技術(shù)Immunodiffusion基本原理：可溶性的抗原和相應(yīng)的抗體在溶液或凝膠中彼此接觸，形成不溶性抗原抗體復(fù)合物沉淀 應(yīng)用： 已知的抗原檢查相應(yīng)的抗體 已知的抗體檢查相應(yīng)的抗原1. 單向免疫擴(kuò)散 (Single immunodiffusion)基本原理：指抗原和抗體兩種成分中只有一種擴(kuò)散，另一種被固定在凝膠中 本法常用于測(cè)定血清IgG、IgM、IgA 和 C3等的含量 2. 雙向免疫擴(kuò)散 （Double immunodiffusion)基本原理：指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在瓊脂介質(zhì)中相互擴(kuò)散，彼此相遇后形成一定類型的特異性沉淀線。如果反應(yīng)體系中含兩種以上的抗原抗體系統(tǒng)，則小孔間可出現(xiàn)兩條以上的沉淀線?！緦?shí)驗(yàn)方法】制板：潔凈的玻片，%瓊脂鋪滿整個(gè)玻片，待凝打孔：按下圖3mm直徑的小孔，孔距5mm加樣：微量進(jìn)樣器從低濃度到高濃度加抗原入外圍孔中，中間孔加抗體保溫?cái)U(kuò)散：28 ℃或37 ℃靜置24h取出瓊脂板，觀察結(jié)果 雙向免疫擴(kuò)散的適用對(duì)象：抗原、抗體相對(duì)含量測(cè)定；抗原、抗體相對(duì)分子量分析二、免疫電泳技術(shù)（Immunoelectrophoresis)基本原理：免疫擴(kuò)散與電泳技術(shù)相結(jié)合。類型：對(duì)流免疫電泳 火箭免疫電離 免疫電泳 雙向免疫電泳（交叉免疫電泳）1. 對(duì)流免疫電泳Counter immunoelectrophoresis 基本原理：多數(shù)蛋白質(zhì)抗原在堿性緩沖液中帶負(fù)電荷，在電泳時(shí)從負(fù)極向正極移動(dòng)?？贵w屬球蛋白，在堿性緩沖液只帶微弱的負(fù)電荷，而且相對(duì)分子質(zhì)量較大，電泳力較小，在瓊脂電滲力作用下反而由正極向負(fù)極移動(dòng)。這樣就使抗原和抗體定向?qū)α鳎趦煽组g相遇時(shí)發(fā)生反應(yīng)，并在比例合適處形成肉眼可見的白色沉淀線 【實(shí)驗(yàn)方法】1制板 2 打孔3加樣:將抗原加入瓊脂糖板上有標(biāo)記孔側(cè)的小孔中，抗體加入另一側(cè)小孔中，以加滿為度，不可溢出孔外。(如圖示)4 電泳:將加好樣品的瓊脂板置電泳槽上，抗原側(cè)置陰極端，抗體孔側(cè)置陽(yáng)極端。搭好橋后，接通電源，控制電壓6～10 V/cm板長(zhǎng)，電泳約30～60 min。關(guān)閉電源，取出瓊脂板，觀察結(jié)果。 2. 火箭免疫電泳（Rocket immunoelectrophoresis)基本原理：也稱免疫擴(kuò)散，抗原在含有定量抗體的瓊脂糖中泳動(dòng)，兩者比例適宜時(shí)，在較短時(shí)間內(nèi)生成錐形的沉淀峰。在一定濃度范圍內(nèi)，沉淀峰的高度與抗原含量成正比。3. 免疫電泳基本原理：是先將待側(cè)樣本作瓊脂凝膠電泳，各蛋白抗原組分被分成不同的區(qū)帶，然后與電泳方向平行挖一小槽，加入相應(yīng)的抗血清，把分成區(qū)帶的蛋白抗原成分作雙向免疫擴(kuò)散，在各區(qū)帶相應(yīng)的位置形成沉淀弧。免疫電泳技術(shù)的用途:對(duì)流免疫電泳——快速、半定量測(cè)定火箭免疫電泳——快速、定量測(cè)定免疫電泳——抗原分析（該法常用于血清蛋白種類分析，以觀察Ig的異常增多或缺失）三、酶聯(lián)免疫分析技術(shù)基本原理 :酶標(biāo)記抗體或酶標(biāo)記抗體進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng)采用抗原與抗體的特異反應(yīng)與酶連接，然后通過(guò)酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測(cè)定 第五章 色譜分析法 第一節(jié) 一、色譜法的定義定義：色譜法 (chromatography)，是一種物理或物理化學(xué)的分離分析方法 原理：利用物質(zhì)在固定相和流動(dòng)相中的分配系數(shù)不同，使混合物中的各組分分離離 《中國(guó)藥典》2005版:一部收載中藥1146個(gè)品種，用薄層色譜進(jìn)行鑒別或含量測(cè)定的有1523項(xiàng)，用高效液相色譜進(jìn)行定量分析的有479種518項(xiàng)，用氣相色譜進(jìn)行檢測(cè)的有47種二部收載的有1967個(gè)品種，采用高效液相色譜法的品種有848種二、色譜法的起源 1．創(chuàng)立：1906年，俄國(guó)植物學(xué)家Tsweet 植物色素分離 2．現(xiàn)狀：一種重要的分離、分析技術(shù)分離混合物各組分并加以分析,還可以進(jìn)行制備: 固定相——除了固體，還可以是液體 流動(dòng)相——液體或氣體 色譜柱——各種材質(zhì)和尺寸 被分離組分——不再僅局限于有色物質(zhì)三、色譜法的特點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：“三高”、“一快”、“一廣” 高選擇性、高效能 、高靈敏度、分析速度快、應(yīng)用范圍廣缺點(diǎn)： 對(duì)未知物分析的定性專屬性差 需要與其他分析方法聯(lián)用(GCMS,LCMS)四、色譜法的分類2．按固定相的固定方式分類第二節(jié) 色譜過(guò)程和基本原理一、色譜過(guò)程、分離原理㈠色譜過(guò)程 指被分離組分在兩相中的“分配”平衡過(guò)程以吸附色譜為例： 吸附→ 解吸→再吸附 →再解吸 →反復(fù)多次洗脫→被測(cè)組分分配系數(shù) 不同→差速遷移→ 分離㈡色譜分離原理： 色譜分離基于各組分在兩相之間平衡分配的差異二、色譜流出曲線㈠色譜流出曲線和色譜峰（二）色譜峰高和峰面積：指組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時(shí)的檢測(cè)信號(hào)，即色譜峰頂至基線的距離：指色譜曲線與基線間包圍的面積第三節(jié) 色譜法的基本類型 根據(jù)色譜法的作用機(jī)制分四種：1分配色譜法 2吸附色譜法 3離子交換色譜法 4空間排阻色譜法一、分配色譜法分離原理：將液體均勻地涂漬在惰性物質(zhì)(載體)表面上作為固定相，利用被分離組分在固定相與流動(dòng)相中的溶解度差別所造成的分配系數(shù)差別而被分離要求：固定相→機(jī)械吸附在惰性載體上的液體,常用的固定液有水、稀硫酸、甲醇、甲酰胺等強(qiáng)極性溶劑 載 體→惰性物質(zhì)，無(wú)吸附性性質(zhì)穩(wěn)定，不與固定相和流動(dòng)相發(fā)生化學(xué)反應(yīng)常用的有吸水硅膠、纖維素、多孔硅藻土等 流動(dòng)相→必須與固定相不為互溶石油醚、醇類、酮類、酯類、鹵代烷及苯等 二、吸附色譜法 各組分與流動(dòng)相分子爭(zhēng)奪吸附劑表面活性中心,、解吸、再吸附、再解吸……最后混合物得到分離（1）對(duì)吸附劑的要求 ①有大的表面積和足夠的吸附能力 ②對(duì)不同的化學(xué)成分有不同的吸附力，能較好地把混合物分開 ③與流動(dòng)相、溶劑及樣品中各成分不起化學(xué)反應(yīng) ④在所用的溶劑及流動(dòng)相中不溶解 ⑤顆粒均勻，操作過(guò)程中不會(huì)碎裂 （2）吸附劑的類別①有機(jī)類 淀粉、葡萄糖、聚酰胺、纖維素等②無(wú)機(jī)類 氧化鋁、硅膠、活性炭、碳酸鈣、 硅藻土等要求 ①應(yīng)使用較純?cè)噭?，含雜質(zhì)會(huì)影響洗脫能力 ②與樣品或吸附劑不發(fā)生化學(xué)反應(yīng) ③能溶解樣品中各成分，且各被分離組分有不同的K值 ④粘度小，易流動(dòng) 三、離子交換色譜法要求：固定相→離子交換樹脂流動(dòng)相→水為溶劑的緩沖溶液被分離組分→離子型的有機(jī)物或無(wú)機(jī)物圖示分離機(jī)制：依據(jù)被測(cè)組分與離子交換劑交換能力（親和力）不同而實(shí)現(xiàn)分離 固定相是離子交換劑 ——常見的是離子交換樹脂，是具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)高分子的聚合物 流動(dòng)相——水、緩沖溶液、或加入少量的乙醇、四氫呋喃、乙腈等有機(jī)溶劑，提高選擇性（四）空間排阻色譜法要求： 固定相→多孔性凝膠 流動(dòng)相→水——凝膠過(guò)濾色譜 流動(dòng)相→有機(jī)溶劑——凝膠滲透色譜 分離機(jī)制見圖示分離機(jī)制：利用被測(cè)組分分子大小不同、在固定相上選擇性 滲透實(shí)現(xiàn)分離2．固定相和流動(dòng)相固定相 多孔凝膠流動(dòng)相 要選對(duì)樣品的溶解好，又能潤(rùn)濕凝膠粘度要低的溶劑，否則，會(huì)限制分子擴(kuò)散而影響分離效果一般水溶性試樣選水溶液，非水溶性試樣選四氫呋喃、氯仿、甲苯和二甲基甲酰胺等有機(jī)溶劑 第六章 生物檢定法 第一節(jié)、生物檢定法概述一、生物檢定涵義生物檢定是利用生物體包括整體動(dòng)物、離體組織/器官、細(xì)胞和微生物等評(píng)估藥物生物活性的一種方法 以藥物的藥理作用為基礎(chǔ)，以生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)在一定條件下比較供試品和相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)，通過(guò)等反應(yīng)劑量間比例的運(yùn)算或限值劑量引起的生物反應(yīng)程度，從而測(cè)定供試品的效價(jià)、生物活性或雜質(zhì)引起的毒性 標(biāo)準(zhǔn)品管理：我國(guó)目前生物檢定所用標(biāo)準(zhǔn)品主要來(lái)源于中國(guó)藥品生物制品檢定所、衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心和WHO的生物標(biāo)準(zhǔn)品實(shí)驗(yàn)室(如NIBSC)，或通過(guò)NIBSC網(wǎng)站( //)訂購(gòu)所需要的國(guó)際生物標(biāo)準(zhǔn)品 實(shí)驗(yàn)室拿到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品或國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品后，可以制備自己的工作標(biāo)準(zhǔn)品。應(yīng)定期對(duì)工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)和效價(jià)測(cè)定，并對(duì)效價(jià)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行趨勢(shì)分析 應(yīng)特別注意工作標(biāo)準(zhǔn)品的使用效期和儲(chǔ)存條件 二、生物檢定類型按生物體分類：體內(nèi)測(cè)定 (in vivo)整體動(dòng)物體外測(cè)定(in vitro)離體器官、組織，微生物和細(xì)胞（原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞）按標(biāo)準(zhǔn)品與供試品異同分類：分析稀釋檢定(analytical dilution assay)S與T為相同物質(zhì)，僅濃度或含量不等 比較稀釋檢定(parative dilution assay)S與T為不同物質(zhì)，但在一定劑量范圍內(nèi)有相同生物反應(yīng) 三、生物反應(yīng)類型量反應(yīng)藥物對(duì)生物體所引起的反應(yīng)是可以計(jì)量大小的。時(shí)反應(yīng)也屬于量反應(yīng)范疇，是觀察某一種反應(yīng)出現(xiàn)所需要的時(shí)間 質(zhì)反應(yīng)當(dāng)一定劑量的藥物注入動(dòng)物體內(nèi)后，觀察某一反應(yīng)或反應(yīng)的某一程度出現(xiàn)與否，只有質(zhì)的變化。此類反應(yīng)只用反應(yīng)率而不能用量來(lái)表示個(gè)體的反應(yīng)程度 四、生物檢定的作用（一）工藝與方法驗(yàn)證對(duì)于新生產(chǎn)工藝、新檢測(cè)方法的改進(jìn)、變更，往往需要生物檢定來(lái)驗(yàn)證核對(duì)。生物檢定可監(jiān)測(cè)不曾預(yù)料、不易發(fā)現(xiàn)的構(gòu)象變化，它是所有變化的綜合效應(yīng) 藥典（BP、ChP）規(guī)定在重組人生長(zhǎng)激素(rhGH)、重組人胰高血糖素質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明確規(guī)定，在生產(chǎn)研發(fā)階段，“生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)品必須用體內(nèi)生物檢定方法測(cè)定其生物效價(jià)”，直到生產(chǎn)穩(wěn)定為止 當(dāng)采用理化方法測(cè)定[如HPLC]替代rhGH、胰島素、人胰高血糖素、降鈣素等原有的生物效價(jià)測(cè)定法時(shí)，仍需作大量的方法比對(duì)、相關(guān)性研究等工作，生物檢定是驗(yàn)證的主要標(biāo)尺 （二） 效價(jià)與活性1. 定量測(cè)定效價(jià)(potency)測(cè)定是生物檢定的主要內(nèi)容，它以藥理為基礎(chǔ)，生物統(tǒng)計(jì)為工具，運(yùn)用特定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用生物體在一定條件下比較供試品與相當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌匪a(chǎn)生的特定反應(yīng)(可測(cè)定、量化的生理指標(biāo)或生物學(xué)特性的變化)，來(lái)測(cè)定藥物生物活性(藥效或毒力)的一種定量的方法，因而被稱為定量藥理學(xué) 整體動(dòng)物的體內(nèi)測(cè)定法，能反映藥物對(duì)人體作用方式，是最經(jīng)典的生物檢定法，因此rhGH等工藝驗(yàn)證要求必須用體內(nèi)生物檢定方法 載入《中國(guó)藥典》(ChP)2005年版二部對(duì)生化藥物的效價(jià)測(cè)定有21個(gè)品種，約占生化藥總數(shù)的10%，其中應(yīng)用體內(nèi)測(cè)定法的有蛋白質(zhì)、肽類激素等 體外生物檢定法包括離體動(dòng)物器官測(cè)定法、細(xì)胞培養(yǎng)(促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、間接保護(hù)細(xì)胞)測(cè)定法、生化酶促反應(yīng)測(cè)定法、免疫學(xué)活性測(cè)定法(已進(jìn)展為基于抗原抗體反應(yīng)，免疫化學(xué)與使用儀器相結(jié)合的高效、便捷方法)等基因重組技術(shù)產(chǎn)品的活性測(cè)定多采用相對(duì)快速、重復(fù)性好的體外測(cè)定的細(xì)胞培養(yǎng)測(cè)定法 雖然某些情況下體外生物檢定