【文章內(nèi)容簡介】 子量大于2000的化合物則應(yīng)選擇孔徑在30nm以上的填料。除另有規(guī)定外，普通分析柱的填充劑粒徑一般在3～10μm之間，粒徑更?。s2μm）的填充劑常用于填裝微徑柱（內(nèi)徑約2mm）。使用微徑柱時，輸液泵的性能、進(jìn)樣體積、檢測池體積和系統(tǒng)的死體積等必須與之匹配；如有必要，色譜條件也需作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。當(dāng)對其測定結(jié)果產(chǎn)生爭議時，應(yīng)以品種項下規(guī)定的色譜條件的測定結(jié)果為準(zhǔn)。以硅膠為載體的鍵合固定相的便用溫度通常不超過40℃，為改善分離效果可適當(dāng)提高色譜柱的使用溫度，但不宜超過60℃。流動相的pH值應(yīng)控制在2～8之間。當(dāng)pH值大子8時，可使載體硅膠溶解；當(dāng)pH值小于2時，與硅膠相連的化學(xué)鍵合相易水解脫落。當(dāng)色譜系統(tǒng)中需使用pH值大于8的流動相時，應(yīng)選用耐堿的填充劑，如采用高純硅膠為載體并具有高表面覆蓋度的鍵合硅膠填充劑、包覆聚合物填充劑、有機無機雜化填充劑或非硅膠基鍵合填充劑等；當(dāng)需使用pH值少于2的流動相時，應(yīng)選用耐酸的填充劑，如具有大體積側(cè)鏈能產(chǎn)生空間位阻保護(hù)作用的二異丙基或二異丁基取代十八烷基硅烷鍵合硅膠填充劑、有機無機雜化填充劑等。（2）檢測器 碩橄匆移最常用的檢測器為紫外檢測器，包括二極管陣列檢測器，其他常見的檢測器有熒光檢測器、蒸發(fā)光散射檢測器、示差折光檢測器、電化學(xué)檢測器和質(zhì)譜檢測器等。紫外、熒先、電化學(xué)檢測器為選擇性檢測器，其響應(yīng)值不僅與供試品溶液的濃度有關(guān)，還與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)；蒸發(fā)光散射檢測器和示差折光檢測器為通用型檢測器，對所有的化合物均有響應(yīng)；蒸發(fā)光散射檢測器對結(jié)構(gòu)類似的化合物，其響應(yīng)值幾乎僅與供試品的質(zhì)量有關(guān)；二極管陣列檢測器可以同時記錄供試品的吸收光譜，故可用于供試品的光譜鑒定和色譜峰的純度檢查。紫外、熒光、電化學(xué)和示差折光檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度在一定范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，但蒸發(fā)光散射檢測器的響應(yīng)值與供試品溶液的濃度通常呈指數(shù)關(guān)系，故進(jìn)行計算時，一般需經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換。不同的檢測器，對流動相的要求不同。如采用紫外檢測器，所用流動相應(yīng)符合紫外可見分光光度法（附錄Ⅴ A）項下對溶劑的要求；采用低波長檢測時，還應(yīng)考慮有機相中有機溶劑的截止使用波長，并選用色譜級有機溶劑。蒸發(fā)光散射檢測器和質(zhì)譜檢測器通常不允許使用含不揮發(fā)性鹽組分的流動相。（3）流動相 反相色譜系統(tǒng)的流動相首選甲醇水系統(tǒng)（采用紫外末端波長檢測時，首選乙腈水系統(tǒng)），如經(jīng)試用不適合時，再選用其他溶劑系統(tǒng)。應(yīng)盡可能少用含有緩沖液的流動相，必須使用時，應(yīng)盡可能選用含較低濃度緩沖液的流動相。由于C18鏈在水相環(huán)境中不易保持伸展?fàn)顟B(tài)，故對于十八烷基硅烷鍵合硅膠為固定相的反相色譜系統(tǒng)，流動相中有機溶劑的比例通常應(yīng)不低于5％，否則C18鏈的隨機卷曲將導(dǎo)致組分保留值變化，造成色譜系統(tǒng)不穩(wěn)定。各品種項下規(guī)定的條件除固定相種類、流動相組分、檢測器類型不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體粒度、流動相流速、混合流動相各組分的比例、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)供試品并達(dá)到系統(tǒng)適用性試驗的要求。其中，調(diào)整流動相組分比例時，以組分比例較低者（小于或等于50％）相對于自身的改變量不超過177。30％且相對于總量的改變量不超過177。10％為限，如30％相對改變量的數(shù)值超過總量的10％時，則改變量以總量的177。10％為限。對于必須使用特定牌號的填充劑方能滿足分離要求的品種，可在該品種項下注明。色譜系統(tǒng)的適用性試驗通常包括理論板數(shù)、分離度、重復(fù)性和拖尾因子等四個參數(shù)。其中，分離度和重復(fù)性尤為重要。按各品種項下要求對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適用性試驗，即用規(guī)定的對照品溶液或系統(tǒng)適用性試驗溶液在規(guī)定的色譜系統(tǒng)進(jìn)行試驗，必要時，可對色譜系統(tǒng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整，以符合要求。（1）色譜柱的理論板數(shù)（n） 用于評價色譜柱的分離效能。由于不同物質(zhì)在同一色譜柱上的色譜行為不同，采用理論板數(shù)作為衡量柱效能的指標(biāo)時，應(yīng)指明測定物質(zhì)，一般為待測組分或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的理論板數(shù)。在規(guī)定的色譜條件下，注入供試品溶液或各品種項下規(guī)定的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)溶液，記錄色譜圖，量出供試品主成分峰或內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的保留時間tR（以分鐘或長度計，下同，但應(yīng)取相同單位）和峰寬（W）或半高峰寬（Wh/2），按n= 16（/W）2或n=（tR／Wh∕2）2計算色譜柱的理論板數(shù)。（2）分離度（R） 用于評價待測組分與相鄰共存物或難分離物質(zhì)之間的分離程度，是衡量色譜系統(tǒng)效能的關(guān)鍵指標(biāo)?？梢酝ㄟ^測定待測物質(zhì)與已知雜質(zhì)的分離度、也可以通過測定待測組分與某一添加的指標(biāo)性成分（內(nèi)標(biāo)物質(zhì)或其他難分離物質(zhì)）的分離度，或?qū)⒐┰嚻坊驅(qū)φ掌酚眠m當(dāng)前方法降解，通過測定待測組分與某一降解產(chǎn)物的分離度舉對色譜系統(tǒng)進(jìn)行評價與控制。無論是定性鑒別還是定量分析，均要求待測峰與其他峰、內(nèi)標(biāo)峰或特定的雜質(zhì)對照峰之間有較好的分離度。除另有規(guī)定外。分離度的計算公式為；21)(212WWttRRR＋－＝ 或 )(70.1)(22/,22/,112hhRRWWttR＋－＝式中 tR2為相鄰兩峰中后一峰的保留時間， tR1為相鄰兩峰中前一峰的保留時間；WW2及W1，h/W2，h/2分別為此相鄰兩峰的峰寬，及半高峰寬（如圖）。當(dāng)對測定結(jié)果有異議時，色譜柱的理論板數(shù)（n）和分離度（R）均以峰寬（W）的計算結(jié)果為準(zhǔn)。（3）重復(fù)性 用于評價連續(xù)進(jìn)樣中，色譜系統(tǒng)響應(yīng)值的重復(fù)性能。采用外標(biāo)法時，通常取各品種項下的對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，除另有規(guī)定外，％；采用內(nèi)標(biāo)法時，通常配制相當(dāng)于80％，100%和120％的對照品溶液，加入規(guī)定量的內(nèi)標(biāo)溶液，配成3種不同濃度的溶液，分別至少進(jìn)樣2次，計算平均校正因子。%。（4）拖尾因子（T） 用于評價色譜峰的對稱性。為保證分離效果和測量精度，應(yīng)檢查待測峰的拖尾因子是否符合各品種項下的規(guī)定。拖尾因子計算公式為：105.02dWTh＝式中 ％峰高處的峰寬；d1為峰頂點至峰前沿之間的距離（如圖）。除另有規(guī)空外，～。峰面積法測定時，若拖尾嚴(yán)重，將影響峰面積的準(zhǔn)確測量。必要時，應(yīng)在各品種項下對拖尾因子作出規(guī)定。（1）內(nèi)標(biāo)法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，分別配成溶液，精密量取各適量，混合配成校正因子側(cè)定用的對照溶液。取一定量注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算校正因子：RRSScAcA＝）校正因子（f式中 AS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； AR為對照品的峰面積或峰高； cS為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； cR為對照品的濃度。再取各品種項下含有內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的供試品溶液，注入儀器，記錄色譜圖，測量供試品中待測成分和內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高，按下式計算含量：39。S39。SXXcAAfc．＝）含量（式中 AX為供試品的峰面積或峰高； cX為供試品的濃度； 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的峰面積或峰高； 為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的濃度； f為校正因子。采用內(nèi)標(biāo)法，可避免因樣品前處理及進(jìn)樣體積誤差對測定結(jié)果的影響。（2）外標(biāo)法 按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取對照品和供試品，配制成溶液，分別精密取一定量，注入儀器，記錄色譜圖，測量對照品溶液和供試品溶液中待測成分的峰面積（或峰高），按下式計算含量：RXRAAc＝)cX含量（ 式中各符號意義同上。由于微量注射器不易精確控制進(jìn)樣量，當(dāng)來用外標(biāo)法測定供試品中成分或雜質(zhì)含量時，以定量環(huán)或自動進(jìn)樣器進(jìn)樣為好。（3）加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時，可采用加校正因子的主成分自身對照法。在建立方法時，按各品種項下的規(guī)定，精密稱（量）取雜質(zhì)對照品和待測成分對照品各適量，配制測定雜質(zhì)校正因子的溶液，進(jìn)樣，記錄色譜圖，按上述（1）法計算雜質(zhì)的校正因子。此校正因子可直接載入各品種項下，用于校正雜質(zhì)的實測峰面積。這些需作校正計算的雜質(zhì)，通常以主成分為參照，采用相對保留時間定位，其數(shù)值一并載入各品種項下。測定雜質(zhì)含量時，按各品種項下規(guī)定的雜質(zhì)限度，將供試品溶液稀釋成與雜質(zhì)限度相當(dāng)?shù)娜芤鹤鳛閷φ杖芤?，進(jìn)樣，調(diào)節(jié)檢測靈敏度（以噪聲水平可接受為限）或進(jìn)樣量（以柱子不過載為限），使對照溶液的主成分色譜峰的峰高約達(dá)滿量程的10%～25％或其峰面積能準(zhǔn)確積分〔％的雜質(zhì)，峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）應(yīng)小于10％；含量在0. 5％～2％的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于5％；含量大于2%的雜質(zhì)，峰面積的RSD應(yīng)小于2％〕。然后，取供試品溶液和對照品溶液適量，分別進(jìn)樣，供試品溶液的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積，分別乘以相應(yīng)的校正因子后與對照溶液主成分的峰面積比較，依法計算各雜質(zhì)含量。（4）不加校正因子的主成分自身對照法 測定雜質(zhì)含量時，若沒有雜質(zhì)對照品，也可采用不加校正因子的主成分自身對照法。同上述（3）法配制對照溶液并調(diào)節(jié)檢測靈敏度后，取供試品溶液和對照溶液適量，分別進(jìn)樣，前者的記錄時間，除另有規(guī)定外，應(yīng)為主成分色譜峰保留時間的2倍，測量供試品溶液色譜圖上各雜質(zhì)的峰面積并與對照溶液主成分的峰面積比較，計算雜質(zhì)含量。若供試品所含的部分雜質(zhì)未與溶劑峰完全分離，則按規(guī)定先記錄供試品溶液的色譜圖Ⅰ，再記錄等體積純?nèi)軇┑纳V圖Ⅱ。色譜圖Ⅰ上雜質(zhì)峰的總面積（包括溶劑峰），減去色譜圖Ⅱ上的溶劑峰面積，即為總雜質(zhì)峰的校正面積。然后依法計算。（5）面積歸一化法 按各品種項下的規(guī)定，配制供試品溶液，取一定量注入儀器，記錄色譜圖。測量各峰的面積和色譜圖上除溶劑峰以外的總色譜峰面積，計算各峰面積占總峰面積的百分率。用于雜質(zhì)檢查時，由于峰面積歸一化法測定誤差大，因此，通常只用于粗略考察供試品中的雜質(zhì)含量。除另有規(guī)定外，一般不宜用于微量雜質(zhì)的檢查。附錄Ⅵ E 氣相色譜法氣相色譜法系采用氣體為流動相（載氣）流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進(jìn)行分離測定的色譜方法，物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進(jìn)行分離，各組分先后進(jìn)入檢測器，用數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。所用的儀器為氣相色譜儀，由載氣源、進(jìn)樣部分、色譜柱、柱溫箱、檢測器和數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等組成。進(jìn)樣部分、色譜柱和檢測器的溫度均應(yīng)根據(jù)分析要求適當(dāng)設(shè)定。（1）載氣源 氣相色譜法的流動相為氣體，稱為載氣，氦、氮和氫可用作載氣，可由高壓鋼瓶或高純度氣體發(fā)生器提供，經(jīng)過適當(dāng)?shù)臏p壓裝置，以一定的流速經(jīng)過進(jìn)樣器和色譜柱；根據(jù)供試品的性質(zhì)和檢測器種類選擇載氣，除另有規(guī)定外，常用載氣為氮氣．（2）進(jìn)樣部分 進(jìn)樣方式一般可采用溶液直接進(jìn)樣、自動進(jìn)樣或頂空進(jìn)樣。溶液直接進(jìn)樣采用微量注射器、微量進(jìn)樣閥或有分流裝置的氣化室進(jìn)樣；采用溶液直接進(jìn)樣或自動進(jìn)樣時，進(jìn)樣口溫度應(yīng)高于柱溫30～50℃；進(jìn)樣量一般不超過數(shù)微升；柱徑越細(xì)，進(jìn)樣量應(yīng)越少，采用毛細(xì)管柱時，一般應(yīng)分流以免過載。頂空進(jìn)樣適用于固體和液體供試品中揮發(fā)性組分的分離和測定。將固態(tài)或液態(tài)的供試品制成供試液后，置于密閉小瓶中，在恒溫控制的加熱室中加熱至供試品中揮發(fā)性組分在液態(tài)和氣態(tài)達(dá)到平衡后，由進(jìn)樣器自動吸取一定體積的頂空氣注入色譜柱中。（3）色譜柱 色譜柱為填充柱或毛細(xì)管柱。填充柱的材質(zhì)為不銹鋼或玻璃，內(nèi)徑為2～4mm，柱長為2～4m，內(nèi)裝吸附劑、高分子多孔小球或涂漬固定液的載體，～，～。常用載體為經(jīng)酸洗并硅烷化處理的硅藻土或高分子多孔小球，常用固定液有甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。毛細(xì)管柱的材質(zhì)為玻璃或石英，內(nèi)壁或載體經(jīng)涂潰或交聯(lián)固定液，柱長5～60m，～，常用的固定液有甲基聚硅氧烷、不同比例組成的苯基甲基聚硅氧烷、聚乙二醇等。新填充柱和毛細(xì)管柱在使用前需老化處理，以除去殘留溶劑及易流失的物質(zhì)，色譜柱如長期未用，使用前應(yīng)老化處理，使基線穩(wěn)定。（4）柱溫箱 由于柱溫箱溫度的波動會影響色譜分析結(jié)果的重現(xiàn)性，因此柱溫箱控溫精度應(yīng)在177。1℃，℃。溫度控制系統(tǒng)分為恒溫和程序升溫兩種。（5）檢測器 適合氣相色譜法的檢測器有火焰離子化檢測器（FID）、熱導(dǎo)檢測器（TCD）、氮磷檢測器（NPD）、火焰光度檢測器（FPD）、電子捕獲檢測器（ECD）、質(zhì)譜檢測器（MS）等?；鹧骐x子化檢測器對碳?xì)浠衔镯憫?yīng)良好，適合檢測大多數(shù)的藥物；氮磷檢測器對含氮、磷元素的化合物靈敏度高；火焰光度檢測器對含磷、硫元素的化合物靈敏度高；電子捕獲檢測器適于含鹵素的化合物；質(zhì)譜檢測器還能給出供試品某個成分相應(yīng)的結(jié)構(gòu)信息，可用于結(jié)構(gòu)確證。除另有規(guī)定外，一般用火焰離子化檢測器，用氫氣作為燃?xì)?，空氣作為助燃?xì)狻Ｔ谑褂没鹧骐x子化檢測器時，檢測器溫度一般應(yīng)高于柱溫，并不得低于150℃，以免水汽凝結(jié)，通常為250～350℃。（6）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng) 可分為記錄儀、積分儀以及計算機工作站等。各品種項下規(guī)定的色譜條件，除檢測器種類、固定液品種及特殊指定的色譜柱材料不得改變外，其余如色譜柱內(nèi)徑、長度、載體牌號、粒度、固定液涂布濃度、載氣流速、柱溫、進(jìn)樣量、檢測器的靈敏度等，均可適當(dāng)改變，以適應(yīng)具體品種并符合系統(tǒng)適用性試驗的要求。一般色譜圖約于30分鐘內(nèi)記錄完畢。除另有規(guī)定外，應(yīng)照高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）項下的規(guī)定。（1）內(nèi)標(biāo)法（2）外標(biāo)法（3）面積歸一化法上述（1）～（3）法的具體內(nèi)容均同高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）項下相應(yīng)的規(guī)定。（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液加入法 精密稱（量）取某個雜質(zhì)或待測成分對照品適量，配制成適當(dāng)濃度的對照品溶液，取一定量，精密加入到供試品溶液中，根據(jù)外標(biāo)法或內(nèi)標(biāo)法測定雜質(zhì)或主成分含量，再扣除加入的對照品溶液含量，即得供試品溶液中某個雜質(zhì)和主成分含量。也可按下述公式進(jìn)行計算，加入對照品溶液前后校正因子應(yīng)相同，即：XXXXiscccAAΔ＋＝則待測組分的濃度cX可通