檢測(cè)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)(編輯修改稿)
2025-08-10 00:14 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)親和層析的基礎(chǔ)上的一種檢測(cè)蛋白質(zhì)間相互作用的分析方法。親和層析的原理如下圖所示，不同蛋白對(duì)配體的親和程度不同，因此可以先將非特異結(jié)合的蛋白用低濃度緩沖液給清洗出去，只剩目的蛋白與層析柱結(jié)合，然后再用洗脫液將目的蛋白洗脫下來，達(dá)到純化目的蛋白的作用。Pulldown技術(shù)利用的是親和層析技術(shù)以及特異的配體（如GSH或者鎳）。以下圖為例，將GST的基因與蛋白X的基因融合，表達(dá)出融合蛋白。將該融合蛋白的溶液過帶有GSH配體的層析柱，那么這一融合蛋白就能結(jié)合在配體上，然后將待測(cè)蛋白的溶液過柱，并讓其與融合蛋白反應(yīng)一段時(shí)間。接著開始進(jìn)行洗脫。如果待測(cè)蛋白與蛋白X無相互作用，那么在開始清洗的時(shí)候就會(huì)被洗下來；如果在用洗脫液洗脫后才能在收集到的樣品中發(fā)現(xiàn)待測(cè)蛋白（以及蛋白X），說明待測(cè)蛋白與蛋白X可能有相互作用。④ Far western blot（in vitro） Far western blot是基于western blot發(fā)展而來，其原理如下圖所示。將樣品蛋白用非變性的PAGE膠分離，然后轉(zhuǎn)膜、封閉、洗膜，加入待測(cè)蛋白，使其與已在膜上的樣品蛋白進(jìn)行相互作用。接著加入帶有標(biāo)記（如HRP）的待測(cè)蛋白的抗體反應(yīng)，最后進(jìn)行顯色（如加入HRP的底物），觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。⑤ 免疫共沉淀（CoIP）（in vivo）免疫共沉淀是探測(cè)活體細(xì)胞內(nèi)蛋白間的相互作用的一門技術(shù)。它的原理是當(dāng)細(xì)胞在非變性條件下被裂解時(shí)，完整細(xì)胞內(nèi)存在的許多蛋白質(zhì)－
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