三代基因組測序技術原理簡介(編輯修改稿)
2025-08-09 20:59 本頁面
【文章內容簡介】 接酶在連接過程之中測序（圖6）2,4。它的原理是：圖6a. Solid測序技術（1）DNA文庫構建 片段打斷并在片段兩端加上測序接頭，連接載體，構建單鏈DNA文庫。 （2）Emulsion PCRSolid的PCR過程也和454的方法類似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來說則要小得多，只有1um。在擴增的同時對擴增產物的3’端進行修飾，這是為下一步的測序過程作的準備。3’修飾的微珠會被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過程中，沉積小室將每張玻片分成1個、4個或8個測序區(qū)域（圖6a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實現更高的通量。 （3）連接酶測序這一步是Solid測序的獨特之處。它并沒有采用以前測序時所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡單表示為：3’XXnnnzzz5’。連接反應中，這些探針按照堿基互補規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對。探針的5’末端分別標記了CYTexas Red、CY6FAM這4種顏色的熒光染料（圖6a）。這個8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據種類的不同在68位（zzz）上加上了不同的熒光標記。這是Solid的獨特測序法，兩個堿基確定一個熒光信號，相當于一次能決定兩個堿基。這種測序方法也稱之為兩堿基測序法。當熒光探針能夠與DNA模板鏈配對而連接上時，就會發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號，圖6a和圖6b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關系。在記錄下熒光信號后，通過化學方法在第5和第6位堿基之間進行切割，這樣就能移除熒光信號，以便進行下一個位置的測序。不過值得注意的是，通過這種測序方法，每次測序的位置都相差5位。即第一次是第2位，第二次是第7位……在測到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n1進行第二輪測序。引物n1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對的位置上相差一個堿基（圖6a. 8）。也即是，通過引物n1在引物n的基礎上將測序位置往3’端移動一個堿基位置，因而就能測定第0、1位和第6位……第二輪測序完成，依此類推，直至第五輪測序，最終可以完成所有位置的堿基測序，并且每個位置的堿基均被檢測了兩次。該技術的讀長在250bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復雜。由于雙次檢測，%，%，應該說是目前第二代測序技術中準確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個熒光信號，因而一旦發(fā)生錯誤就容易產生連鎖的解碼錯誤。圖6b. Solid測序技術第三代測序技術測序技術在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測序技術，被稱之為第三代測序技術。與前兩代相比，他們最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增。其中PacBio SMRT技術其實也應用了邊合成邊測序的思想5，并以SMRT芯片為測序載體?；驹硎牵?DNA聚合酶和模板結合,4色熒光標記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對階段,不同堿基的加入,會發(fā)出不同光,根據光的波長與峰值可判斷進入的堿基類型。同時這個 DNA 聚合酶是實現超長讀長的關鍵之一,讀長主要跟酶的活性保持有關,它主要受激光對其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術的一個關鍵是怎樣將反應信號與周圍游離堿基的強大熒光背景區(qū)別出來。他們利用的是ZMW（零模波導孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長,能量就會在衍射效應的作用下穿透面板而泄露出來，從而與周圍小孔相互干擾。如果孔徑小于波長,能量不會輻射到周圍，而是保持直線狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護作用。同理,在一個反應管(SMRTCell:單分子實時反應孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導孔),外徑 100多納米,比檢測激光波長小(數百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進入上方溶液區(qū),能量被限制在一個小范圍(體積20X 1021 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測的部分,使得信號僅來自這個小反應區(qū)域,孔外過多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實現將背景降到最低。另外，可以通過檢測相鄰兩個堿基之間的測序時間，來檢測一些堿基
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