三代基因組測(cè)序技術(shù)原理簡(jiǎn)介(編輯修改稿)
2025-08-09 20:59 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 接酶在連接過(guò)程之中測(cè)序（圖6）2,4。它的原理是：圖6a. Solid測(cè)序技術(shù)（1）DNA文庫(kù)構(gòu)建 片段打斷并在片段兩端加上測(cè)序接頭，連接載體，構(gòu)建單鏈DNA文庫(kù)。 （2）Emulsion PCRSolid的PCR過(guò)程也和454的方法類(lèi)似，同樣采用小水滴emulsion PCR，但這些微珠比起454系統(tǒng)來(lái)說(shuō)則要小得多，只有1um。在擴(kuò)增的同時(shí)對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物的3’端進(jìn)行修飾，這是為下一步的測(cè)序過(guò)程作的準(zhǔn)備。3’修飾的微珠會(huì)被沉積在一塊玻片上。在微珠上樣的過(guò)程中，沉積小室將每張玻片分成1個(gè)、4個(gè)或8個(gè)測(cè)序區(qū)域（圖6a）。Solid系統(tǒng)最大的優(yōu)點(diǎn)就是每張玻片能容納比454更高密度的微珠，在同一系統(tǒng)中輕松實(shí)現(xiàn)更高的通量。 （3）連接酶測(cè)序這一步是Solid測(cè)序的獨(dú)特之處。它并沒(méi)有采用以前測(cè)序時(shí)所常用的DNA聚合酶，而是采用了連接酶。Solid連接反應(yīng)的底物是8堿基單鏈熒光探針混合物，這里將其簡(jiǎn)單表示為：3’XXnnnzzz5’。連接反應(yīng)中，這些探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對(duì)。探針的5’末端分別標(biāo)記了CYTexas Red、CY6FAM這4種顏色的熒光染料（圖6a）。這個(gè)8堿基單鏈熒光探針中，第1和第2位堿基（XX）上的堿基是確定的，并根據(jù)種類(lèi)的不同在68位（zzz）上加上了不同的熒光標(biāo)記。這是Solid的獨(dú)特測(cè)序法，兩個(gè)堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，相當(dāng)于一次能決定兩個(gè)堿基。這種測(cè)序方法也稱(chēng)之為兩堿基測(cè)序法。當(dāng)熒光探針能夠與DNA模板鏈配對(duì)而連接上時(shí)，就會(huì)發(fā)出代表第1，2位堿基的熒光信號(hào)，圖6a和圖6b中的比色版所表示的是第1，2位堿基的不同組合與熒光顏色的關(guān)系。在記錄下熒光信號(hào)后，通過(guò)化學(xué)方法在第5和第6位堿基之間進(jìn)行切割，這樣就能移除熒光信號(hào)，以便進(jìn)行下一個(gè)位置的測(cè)序。不過(guò)值得注意的是，通過(guò)這種測(cè)序方法，每次測(cè)序的位置都相差5位。即第一次是第2位，第二次是第7位……在測(cè)到末尾后，要將新合成的鏈變性，洗脫。接著用引物n1進(jìn)行第二輪測(cè)序。引物n1與引物n的區(qū)別是，二者在與接頭配對(duì)的位置上相差一個(gè)堿基（圖6a. 8）。也即是，通過(guò)引物n1在引物n的基礎(chǔ)上將測(cè)序位置往3’端移動(dòng)一個(gè)堿基位置，因而就能測(cè)定第0、1位和第6位……第二輪測(cè)序完成，依此類(lèi)推，直至第五輪測(cè)序，最終可以完成所有位置的堿基測(cè)序，并且每個(gè)位置的堿基均被檢測(cè)了兩次。該技術(shù)的讀長(zhǎng)在250bp，后續(xù)序列拼接同樣比較復(fù)雜。由于雙次檢測(cè)，%，%，應(yīng)該說(shuō)是目前第二代測(cè)序技術(shù)中準(zhǔn)確性最高的了。但在熒光解碼階段，鑒于其是雙堿基確定一個(gè)熒光信號(hào)，因而一旦發(fā)生錯(cuò)誤就容易產(chǎn)生連鎖的解碼錯(cuò)誤。圖6b. Solid測(cè)序技術(shù)第三代測(cè)序技術(shù)測(cè)序技術(shù)在近兩三年中又有新的里程碑。以PacBio公司的SMRT和Oxford Nanopore Technologies納米孔單分子測(cè)序技術(shù)，被稱(chēng)之為第三代測(cè)序技術(shù)。與前兩代相比，他們最大的特點(diǎn)就是單分子測(cè)序，測(cè)序過(guò)程無(wú)需進(jìn)行PCR擴(kuò)增。其中PacBio SMRT技術(shù)其實(shí)也應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想5，并以SMRT芯片為測(cè)序載體?；驹硎牵?DNA聚合酶和模板結(jié)合,4色熒光標(biāo)記 4 種堿基（即是dNTP）,在堿基配對(duì)階段,不同堿基的加入,會(huì)發(fā)出不同光,根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類(lèi)型。同時(shí)這個(gè) DNA 聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一,讀長(zhǎng)主要跟酶的活性保持有關(guān),它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響。PacBio SMRT技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵是怎樣將反應(yīng)信號(hào)與周?chē)坞x堿基的強(qiáng)大熒光背景區(qū)別出來(lái)。他們利用的是ZMW（零模波導(dǎo)孔）原理：如同微波爐壁上可看到的很多密集小孔。小孔直徑有考究,如果直徑大于微波波長(zhǎng),能量就會(huì)在衍射效應(yīng)的作用下穿透面板而泄露出來(lái)，從而與周?chē)】紫嗷ジ蓴_。如果孔徑小于波長(zhǎng),能量不會(huì)輻射到周?chē)潜３种本€(xiàn)狀態(tài)（光衍射的原理）,從而可起保護(hù)作用。同理,在一個(gè)反應(yīng)管(SMRTCell:單分子實(shí)時(shí)反應(yīng)孔)中有許多這樣的圓形納米小孔, 即 ZMW(零模波導(dǎo)孔),外徑 100多納米,比檢測(cè)激光波長(zhǎng)小(數(shù)百納米),激光從底部打上去后不能穿透小孔進(jìn)入上方溶液區(qū),能量被限制在一個(gè)小范圍(體積20X 1021 L)里,正好足夠覆蓋需要檢測(cè)的部分,使得信號(hào)僅來(lái)自這個(gè)小反應(yīng)區(qū)域,孔外過(guò)多游離核苷酸單體依然留在黑暗中,從而實(shí)現(xiàn)將背景降到最低。另外，可以通過(guò)檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間，來(lái)檢測(cè)一些堿基
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