下一代測序技術(shù)(編輯修改稿)
2025-07-03 19:06 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 可以減少由于讀錯帶來的錯誤，使測序結(jié)果的錯誤率低于萬分之一，但在提高讀長的同時降低錯誤率仍然是第二代測序平臺努力的方向。 基于以上分析，就目前情況而言，傳統(tǒng)Sanger法仍然在小規(guī)模的測序應(yīng)用上（比如質(zhì)粒等，從幾十個堿基到百萬堿基）有很大市場，畢竟這些應(yīng)用在讀長和準確性方面的要求高，而新技術(shù)的高通量和低成本發(fā)揮不出明顯的優(yōu)勢。而在大規(guī)?；蚪M測序上，盡管有如上所述的挑戰(zhàn)，新一代測序技術(shù)在成本和效率方面的優(yōu)勢實在太過突出，將會發(fā)揮主要作用，并且這種技術(shù)在未來數(shù)年還有很大改進提高的空間。在De novo全基因組測序上，將依賴新測序平臺的“雙向測序”（pairend，即從片段兩端測序）和Sanger法的長片段測序，將兩種方法結(jié)合將會收到更好的效果。因此，我們目前應(yīng)該根據(jù)不同任務(wù)的特點選擇合適的方法。45Solexa和SOLiD三種新一代測序技術(shù)有其相似之處：都需要對樣品進行體外擴增，都將擴增子大規(guī)模原位雜交在芯片上通過CCD拍攝來檢測熒光信號，因此，也被統(tǒng)稱為循環(huán)芯片測序技術(shù)（Cyclic array sequencing）。Helicos單分子測序除了不需要進行擴增，其它過程也類似。各種不同的新一代測序技術(shù)也有自身的特點，總結(jié)在表一。第一，45Solexa、SOLiD測序平臺在測序前要進行PCR擴增，Solexa采用了比較特殊的橋式PCR擴增，而HeliScope測序儀由于提高了檢測靈敏度，不需要擴增。第二，454平臺的讀長遠高于其它平臺。第三，在讀錯率方面，由于測序原理的差異，各種平臺的讀錯類型不同。454和HeliScope對同聚序列的識別使其主要對單堿基的插入和缺失（indel）易讀錯，不同于其它平臺的堿基替換(Substitution)錯誤。并且，SOLiD的讀錯率低于454和Solexa, 而HeliScope最低。第四，在數(shù)據(jù)分析方面，SOLiD技術(shù)由于其特殊的“雙堿基解碼”原理（2 base encoding）,能夠有效識別SNP位點并降低讀錯率，但必須使用特有的分析軟件，提高了分析難度，而其它平臺可以采用統(tǒng)一的軟件。第五，從單堿基成本來看，454較高，Solexa相對較低，其它平臺處在相似的水平。最后，從樣品制備來看，使用乳液PCR過程要比橋式PCR繁瑣，而HeliScope由于沒有PCR過程，樣品制備最為簡單快捷。平臺測序原理PCR類型一個run通量（reads）一個run的有效數(shù)據(jù)量（MB）一個run的時間是否支持雙向測序(PE,Pair end)Roche 454邊合成邊測序乳液PCR400，000100（SE）（SE）是Illumina GA邊合成邊測序橋式PCR50,000,000?10,000(PE)6天（PE）是AB SOLiD邊連接邊測序乳液PCR400,000,00011,000(PE)6天（PE）是HeliScope邊合成邊測序不需要PCR1,000,000,00060,000（PE）14天（PE）是平臺讀長Pair end樣品制備時間每百萬堿基成本（$）儀器價格（$）讀錯率讀錯類型Roche 454300400bp23小時60500,000%插入缺失Illumina GA3645bp2天2430,000%替換AB SOLiD35bp2591,000%替換HeliScope30bp未知11,350,000%缺失 表一 主要新一代測序平臺的比較6. 新一代測序技術(shù)的應(yīng)用 新一代測序技術(shù)大大加快了測序速度，同時降低了成本，在許多研究領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。其中包括：全基因組de novo測序（whole genome de novo seuqencing），全基因組重測序(whole genome reseuquencing)，基因組目的區(qū)域重測序(targeted genome resequencing)，小RNA測序(small RNA profiling)，基因表達譜測序（gene expression profiling），轉(zhuǎn)錄組測序（transcriptome sequencing），DNA甲基化（methylation）大規(guī)模檢測，用染色質(zhì)免疫共沉淀法（ChipSeq）繪制基因組DNA蛋白相互作用圖譜，生物群體基因組檢測（metagenomics），基因拷貝數(shù)變異（copy number variation）等。相信在未來數(shù)年里，新測序技術(shù)的應(yīng)用將更加廣泛。7. 其它正在研發(fā)中的下一代測序技術(shù) 雜交測序技術(shù)（SBH, Sequencing by Hybridization）早在1989年前南斯拉夫人Rade Dramanac就在Genomics上提出了雜交測序技術(shù)的構(gòu)想和相關(guān)細節(jié)，后來將此技術(shù)應(yīng)用在檢測p53基因變體序列，探索了其在分子診斷方面的應(yīng)用。雜交測序技術(shù)的核心在于使用包含全部序列的一定大小的寡聚核苷酸探針（比如512條五核苷酸探針，2048條六核苷酸探針），與固定在芯片表面的基因組片段雜交。由于每條探針都有熒光標記，就能得到每個基因組片段對所有探針的
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