【文章內容簡介】 這些三維結構不僅僅包含有圖像、結構信息，而且還能隨著結構的變化應用于納米技術、藥物載體、DNA計算等方面。2008年Yossi Weizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術緊密結合的一個例子23。首先，利用DNA分子互補，將兩環(huán)相接觸部分的DNA序列設計為互補，雜交后再經連接酶連接，就形成了穩(wěn)定的環(huán)鏈結構。通過AFM電鏡檢測，也能夠看到環(huán)鏈結構的存在。另外，將一個環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應頭上，而與其有互補序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當雜交并且被連接后，其感應力較未被連接有了顯著提高，側面說明環(huán)套結構的存在。在此基礎上，還設計了將DNA環(huán)分別固定在兩個金微粒（）上，然后利用內切酶進行切割分離的實驗。實驗結果證明，這些操作都可以在環(huán)套結構上成功實現(xiàn)。除了上述電鏡檢測外，Yossi Weizmann等還利用熒光技術進行了一系列實驗。首先，如圖A所示，將四甲基羅丹明標記在短寡核苷酸上，通過雜交，形成環(huán)套和多個短寡核苷酸復合物。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。然后，使用四甲基羅丹明標記的凝血酶，當凝血酶結合在環(huán)套的側面時，利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA，并伴有多節(jié)膨大結構。同時，還對環(huán)套結構進行了類似的雙熒光探針雜交，結果發(fā)現(xiàn)產生了熒光共振能量轉移。因為只有當兩個熒光基和淬滅基的距離小于5nm時，才會出現(xiàn)能量轉移，因此，也說明環(huán)套結構是有序排列存在的。圖71 環(huán)鏈結構組成 圖72熒光段寡核苷酸和凝血酶標記的環(huán)鏈 圖73 DNA盒子蓋開閉示意圖2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地將DNA熒光技術應用在檢測納米裝置開啟和閉合24。為了檢測DNA分子納米盒子的蓋子的開閉，分別在蓋子和盒體上標記了Cy3和Cy5熒光染料（見圖73）。當加入“鑰匙”DNA鏈時，盒子蓋打開，兩個熒光分子分開。此時，Cy3的熒光信號增加，而Cy5熒光信號下降。在該實驗中，利用熒光信號增減可以有效地檢測DNA納米裝置的空間變化。 與DNA變構相結合的熒光技術通過DNA分子的不同狀態(tài)，構建可控的熒光納米裝置。隨著DNA分子的變構，其熒光強度也隨之變化。因此，通過檢測熒光強度就可以知道DNA分子的構象變化。1999年，Mao等構建了一種基于DNA分子變構的納米裝置25。其應用的原理就是B、Z型DNA的相互轉換。BDNA就是我們所熟悉的右手螺旋結構。但是，對于含有多個GC的重復序列，當離子濃度發(fā)生變化時，就會伸展為左旋結構。如圖81所示的DNA復合結構是由三條鏈組成的。其中，藍色的兩條鏈相同。在每個連接的轉折處都由4的相連的T組成。在這個復合結構的中部，也就是黃色標記的序列，其中含有多個GC的重復序列。當改變離子濃度時，該區(qū)域就會伸展成為左旋結構。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置（圓點）。那末只有當復合結構是BDNA時，才能通過能量轉移激發(fā)出熒光。當其為ZDNA時，由于兩個基團距離加大，從而無法實現(xiàn)能量轉移。圖82為B、Z型DNA轉換時其能量轉移的變化。圖81 DNA復合結構變構示意圖 圖82 DNA轉換時其能量轉移3 近期熒光技術的新發(fā)展熒光技術發(fā)展速度很快，在DNA計算、信息學、物理學等諸多領域具有很大的應用潛力。下面介紹幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術，希望能為DNA計算提供新的思路。（1）熒光分子信標信號放大技術；（2）與磁珠技術相結合的熒光技術（3）與PH值變化相結合的DNA熒光技術；（4）與miRNAs檢測相結合的熒光技術。分子信標技術是目前較為成熟的技術，尤其是在檢測方面有著重要的應用。但是當檢測物很少時，分子信標產生的熒光就不足以被檢測，甚至發(fā)生錯誤信號。2008年，Gary K Geiss等報道了一種基因表達的多色熒光分析系統(tǒng)26。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標記等多種技術。2005年，Ernest K. Lewis等設計了能同時激發(fā)多種熒光的方法，使得DNA檢測速度以及準確度都大大提高27。2008，Jianwei Jeffery Li等提高了熒光分子信標的信號強度28。其原理（如圖91所示）就是先通過普通的分子信標雜交過程，待分子雜交產生熒光信號后，此時，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開的分子信標切斷，并釋放。從而，再進行新的一輪分子信標雜交釋放。那末熒光信號就會積累增多。在此基礎上，還建立了一種加強型熒光分子信標信號放大技術（如圖92所示）。首先，與目標片斷互補的單鏈DNA雜交，再使用連接酶進行連接成環(huán)。隨后，利用DNA聚合酶216。29以環(huán)狀DNA為模板，加入單引物進行PCR。在隨后擴增的線性模板上，就含有多處目標片斷。此時，再進行上述的熒光分子信標信號放大。就可以大大提高信號強度。圖91 熒光信號積累原理 圖92 加強型熒光分子信標信號放大原理磁珠技術，使得DNA分子的捕捉和釋放變?yōu)榭赡?。通過DNA特異性雜交，可以特異性的獲取DNA分子。2005年，Hui Xu等就將磁珠技術與熒光技術相結合，建立新型的DNA檢測系統(tǒng)29。首先，將標記生物素的DNA1與磁珠相結合。通過目標DNA3，可以使DNA3相互雜交，形成復合體。在DNA3上標記有熒光集團。通過磁珠分離，將捕獲的DNA2和目標DNA3洗脫。由于DNA分子本省帶有負電荷，于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯（被標記有特殊基團）吸附。此時就會產生能量轉移，從而產生熒光，并被檢測（如圖10所示）。圖10與磁珠技術相結合的DNA檢測熒光技術原理DNA的構象會隨著PH值的變化而改變。利用這一特性，2005年，DongSheng Liu等構建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。整個裝置是由DNA寡核苷酸陣列構成的。在每個寡核苷酸的5’端標記有SH，隨后是由CCCC4個胞嘧啶組成的DNA序列，在3’端標記有若丹明綠色熒光基團。每個DNA寡核苷酸被固定在金表面。當PH值較低時（49之間），有些胞嘧啶會發(fā)生質子化，從而與其他胞嘧啶產生分子間非經典配對。此時，寡核苷酸鏈就會形成蜷縮狀結構，而不會與互補鏈雜交（如圖111所示）。在這種狀態(tài)下，熒光集團非?？拷鸨砻妫s1nm），此時就不能被激發(fā)光激發(fā)。隨著PH值的增大，胞嘧啶質子化程度降低，其分子間非經典配對也隨之降低。若加入互補鏈，在金表面，展開的寡核苷酸會與互補鏈雜交，使得寡核苷酸3’端的熒光集團遠離金表面（約8nm）。當有激發(fā)光激發(fā)時，就會產生綠色熒光，實驗還證實這種熒光的變化是可逆的。通過控制PH值，可以有效地進行熒光變化。圖111 原理圖圖112 隨著PH值熒光可逆地進行變化?！：；b：；ｃ：；ｄ：； 與miRNAs檢測相結合的熒光技術 miRNAs在真核生物的調控中發(fā)揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低，檢測起來比較困難。結合DNA寡核苷酸微列陣技術、熒光技術、酶切、酶聯(lián)技術，2004年Peter T Nelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數(shù)個胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補序列。將寡核苷酸鏈5’端共價連在芯片玻璃表面。其次，當miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時，用核酸外切酶Ⅰ處理，將沒有特異性雜交上miRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價連接有生物素的dATP進行擴增。最后，加入共價連接有熒光基團的鏈合霉素，使其與連接有生物素的DNA鏈結合。通過激發(fā)熒光，保留下來的、并被擴增了的寡核苷酸區(qū)域就會發(fā)出熒光。其熒光量的多少，還能顯示該miRNAs量的多少。圖12 RAKE原理示意圖4 展望在生物技術高速發(fā)展的今天，DNA計算的研究也是日新月異。近年