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dna計算中熒光技術的應用及其發(fā)展(編輯修改稿)

2024-07-26 08:01 本頁面
 

【文章內容簡介】 這些三維結構不僅僅包含有圖像、結構信息,而且還能隨著結構的變化應用于納米技術、藥物載體、DNA計算等方面。2008年Yossi Weizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術緊密結合的一個例子23。首先,利用DNA分子互補,將兩環(huán)相接觸部分的DNA序列設計為互補,雜交后再經連接酶連接,就形成了穩(wěn)定的環(huán)鏈結構。通過AFM電鏡檢測,也能夠看到環(huán)鏈結構的存在。另外,將一個環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應頭上,而與其有互補序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當雜交并且被連接后,其感應力較未被連接有了顯著提高,側面說明環(huán)套結構的存在。在此基礎上,還設計了將DNA環(huán)分別固定在兩個金微粒()上,然后利用內切酶進行切割分離的實驗。實驗結果證明,這些操作都可以在環(huán)套結構上成功實現(xiàn)。除了上述電鏡檢測外,Yossi Weizmann等還利用熒光技術進行了一系列實驗。首先,如圖A所示,將四甲基羅丹明標記在短寡核苷酸上,通過雜交,形成環(huán)套和多個短寡核苷酸復合物。在電鏡下,可以觀察到柱狀熒光條帶。然后,使用四甲基羅丹明標記的凝血酶,當凝血酶結合在環(huán)套的側面時,利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA,并伴有多節(jié)膨大結構。同時,還對環(huán)套結構進行了類似的雙熒光探針雜交,結果發(fā)現(xiàn)產生了熒光共振能量轉移。因為只有當兩個熒光基和淬滅基的距離小于5nm時,才會出現(xiàn)能量轉移,因此,也說明環(huán)套結構是有序排列存在的。圖71 環(huán)鏈結構組成 圖72熒光段寡核苷酸和凝血酶標記的環(huán)鏈 圖73 DNA盒子蓋開閉示意圖2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地將DNA熒光技術應用在檢測納米裝置開啟和閉合24。為了檢測DNA分子納米盒子的蓋子的開閉,分別在蓋子和盒體上標記了Cy3和Cy5熒光染料(見圖73)。當加入“鑰匙”DNA鏈時,盒子蓋打開,兩個熒光分子分開。此時,Cy3的熒光信號增加,而Cy5熒光信號下降。在該實驗中,利用熒光信號增減可以有效地檢測DNA納米裝置的空間變化。 與DNA變構相結合的熒光技術通過DNA分子的不同狀態(tài),構建可控的熒光納米裝置。隨著DNA分子的變構,其熒光強度也隨之變化。因此,通過檢測熒光強度就可以知道DNA分子的構象變化。1999年,Mao等構建了一種基于DNA分子變構的納米裝置25。其應用的原理就是B、Z型DNA的相互轉換。BDNA就是我們所熟悉的右手螺旋結構。但是,對于含有多個GC的重復序列,當離子濃度發(fā)生變化時,就會伸展為左旋結構。如圖81所示的DNA復合結構是由三條鏈組成的。其中,藍色的兩條鏈相同。在每個連接的轉折處都由4的相連的T組成。在這個復合結構的中部,也就是黃色標記的序列,其中含有多個GC的重復序列。當改變離子濃度時,該區(qū)域就會伸展成為左旋結構。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置(圓點)。那末只有當復合結構是BDNA時,才能通過能量轉移激發(fā)出熒光。當其為ZDNA時,由于兩個基團距離加大,從而無法實現(xiàn)能量轉移。圖82為B、Z型DNA轉換時其能量轉移的變化。圖81 DNA復合結構變構示意圖 圖82 DNA轉換時其能量轉移3 近期熒光技術的新發(fā)展熒光技術發(fā)展速度很快,在DNA計算、信息學、物理學等諸多領域具有很大的應用潛力。下面介紹幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術,希望能為DNA計算提供新的思路。(1)熒光分子信標信號放大技術;(2)與磁珠技術相結合的熒光技術(3)與PH值變化相結合的DNA熒光技術;(4)與miRNAs檢測相結合的熒光技術。分子信標技術是目前較為成熟的技術,尤其是在檢測方面有著重要的應用。但是當檢測物很少時,分子信標產生的熒光就不足以被檢測,甚至發(fā)生錯誤信號。2008年,Gary K Geiss等報道了一種基因表達的多色熒光分析系統(tǒng)26。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標記等多種技術。2005年,Ernest K. Lewis等設計了能同時激發(fā)多種熒光的方法,使得DNA檢測速度以及準確度都大大提高27。2008,Jianwei Jeffery Li等提高了熒光分子信標的信號強度28。其原理(如圖91所示)就是先通過普通的分子信標雜交過程,待分子雜交產生熒光信號后,此時,加入特異的缺刻DNA酶,即將因雜交而展開的分子信標切斷,并釋放。從而,再進行新的一輪分子信標雜交釋放。那末熒光信號就會積累增多。在此基礎上,還建立了一種加強型熒光分子信標信號放大技術(如圖92所示)。首先,與目標片斷互補的單鏈DNA雜交,再使用連接酶進行連接成環(huán)。隨后,利用DNA聚合酶216。29以環(huán)狀DNA為模板,加入單引物進行PCR。在隨后擴增的線性模板上,就含有多處目標片斷。此時,再進行上述的熒光分子信標信號放大。就可以大大提高信號強度。圖91 熒光信號積累原理 圖92 加強型熒光分子信標信號放大原理磁珠技術,使得DNA分子的捕捉和釋放變?yōu)榭赡?。通過DNA特異性雜交,可以特異性的獲取DNA分子。2005年,Hui Xu等就將磁珠技術與熒光技術相結合,建立新型的DNA檢測系統(tǒng)29。首先,將標記生物素的DNA1與磁珠相結合。通過目標DNA3,可以使DNA3相互雜交,形成復合體。在DNA3上標記有熒光集團。通過磁珠分離,將捕獲的DNA2和目標DNA3洗脫。由于DNA分子本省帶有負電荷,于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯(被標記有特殊基團)吸附。此時就會產生能量轉移,從而產生熒光,并被檢測(如圖10所示)。圖10與磁珠技術相結合的DNA檢測熒光技術原理DNA的構象會隨著PH值的變化而改變。利用這一特性,2005年,DongSheng Liu等構建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。整個裝置是由DNA寡核苷酸陣列構成的。在每個寡核苷酸的5’端標記有SH,隨后是由CCCC4個胞嘧啶組成的DNA序列,在3’端標記有若丹明綠色熒光基團。每個DNA寡核苷酸被固定在金表面。當PH值較低時(49之間),有些胞嘧啶會發(fā)生質子化,從而與其他胞嘧啶產生分子間非經典配對。此時,寡核苷酸鏈就會形成蜷縮狀結構,而不會與互補鏈雜交(如圖111所示)。在這種狀態(tài)下,熒光集團非??拷鸨砻妫s1nm),此時就不能被激發(fā)光激發(fā)。隨著PH值的增大,胞嘧啶質子化程度降低,其分子間非經典配對也隨之降低。若加入互補鏈,在金表面,展開的寡核苷酸會與互補鏈雜交,使得寡核苷酸3’端的熒光集團遠離金表面(約8nm)。當有激發(fā)光激發(fā)時,就會產生綠色熒光,實驗還證實這種熒光的變化是可逆的。通過控制PH值,可以有效地進行熒光變化。圖111 原理圖圖112 隨著PH值熒光可逆地進行變化?!:;b:;c:;d:; 與miRNAs檢測相結合的熒光技術 miRNAs在真核生物的調控中發(fā)揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低,檢測起來比較困難。結合DNA寡核苷酸微列陣技術、熒光技術、酶切、酶聯(lián)技術,2004年Peter T Nelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個寡核苷酸由三部分組成:支架序列、數(shù)個胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補序列。將寡核苷酸鏈5’端共價連在芯片玻璃表面。其次,當miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時,用核酸外切酶Ⅰ處理,將沒有特異性雜交上miRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時,使用DNA聚合酶Klenow,以miRNAs為引物,以保留下來的寡核苷酸鏈為模板,再加入共價連接有生物素的dATP進行擴增。最后,加入共價連接有熒光基團的鏈合霉素,使其與連接有生物素的DNA鏈結合。通過激發(fā)熒光,保留下來的、并被擴增了的寡核苷酸區(qū)域就會發(fā)出熒光。其熒光量的多少,還能顯示該miRNAs量的多少。圖12 RAKE原理示意圖4 展望在生物技術高速發(fā)展的今天,DNA計算的研究也是日新月異。近年
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