【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 這些三維結(jié)構(gòu)不僅僅包含有圖像、結(jié)構(gòu)信息，而且還能隨著結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)用于納米技術(shù)、藥物載體、DNA計(jì)算等方面。2008年Yossi Weizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術(shù)緊密結(jié)合的一個(gè)例子23。首先，利用DNA分子互補(bǔ)，將兩環(huán)相接觸部分的DNA序列設(shè)計(jì)為互補(bǔ)，雜交后再經(jīng)連接酶連接，就形成了穩(wěn)定的環(huán)鏈結(jié)構(gòu)。通過AFM電鏡檢測(cè)，也能夠看到環(huán)鏈結(jié)構(gòu)的存在。另外，將一個(gè)環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應(yīng)頭上，而與其有互補(bǔ)序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。當(dāng)雜交并且被連接后，其感應(yīng)力較未被連接有了顯著提高，側(cè)面說明環(huán)套結(jié)構(gòu)的存在。在此基礎(chǔ)上，還設(shè)計(jì)了將DNA環(huán)分別固定在兩個(gè)金微粒（）上，然后利用內(nèi)切酶進(jìn)行切割分離的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，這些操作都可以在環(huán)套結(jié)構(gòu)上成功實(shí)現(xiàn)。除了上述電鏡檢測(cè)外，Yossi Weizmann等還利用熒光技術(shù)進(jìn)行了一系列實(shí)驗(yàn)。首先，如圖A所示，將四甲基羅丹明標(biāo)記在短寡核苷酸上，通過雜交，形成環(huán)套和多個(gè)短寡核苷酸復(fù)合物。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。然后，使用四甲基羅丹明標(biāo)記的凝血酶，當(dāng)凝血酶結(jié)合在環(huán)套的側(cè)面時(shí)，利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA，并伴有多節(jié)膨大結(jié)構(gòu)。同時(shí)，還對(duì)環(huán)套結(jié)構(gòu)進(jìn)行了類似的雙熒光探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。因?yàn)橹挥挟?dāng)兩個(gè)熒光基和淬滅基的距離小于5nm時(shí)，才會(huì)出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移，因此，也說明環(huán)套結(jié)構(gòu)是有序排列存在的。圖71 環(huán)鏈結(jié)構(gòu)組成 圖72熒光段寡核苷酸和凝血酶標(biāo)記的環(huán)鏈 圖73 DNA盒子蓋開閉示意圖2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地將DNA熒光技術(shù)應(yīng)用在檢測(cè)納米裝置開啟和閉合24。為了檢測(cè)DNA分子納米盒子的蓋子的開閉，分別在蓋子和盒體上標(biāo)記了Cy3和Cy5熒光染料（見圖73）。當(dāng)加入“鑰匙”DNA鏈時(shí)，盒子蓋打開，兩個(gè)熒光分子分開。此時(shí)，Cy3的熒光信號(hào)增加，而Cy5熒光信號(hào)下降。在該實(shí)驗(yàn)中，利用熒光信號(hào)增減可以有效地檢測(cè)DNA納米裝置的空間變化。 與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)通過DNA分子的不同狀態(tài)，構(gòu)建可控的熒光納米裝置。隨著DNA分子的變構(gòu)，其熒光強(qiáng)度也隨之變化。因此，通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度就可以知道DNA分子的構(gòu)象變化。1999年，Mao等構(gòu)建了一種基于DNA分子變構(gòu)的納米裝置25。其應(yīng)用的原理就是B、Z型DNA的相互轉(zhuǎn)換。BDNA就是我們所熟悉的右手螺旋結(jié)構(gòu)。但是，對(duì)于含有多個(gè)GC的重復(fù)序列，當(dāng)離子濃度發(fā)生變化時(shí)，就會(huì)伸展為左旋結(jié)構(gòu)。如圖81所示的DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)是由三條鏈組成的。其中，藍(lán)色的兩條鏈相同。在每個(gè)連接的轉(zhuǎn)折處都由4的相連的T組成。在這個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)的中部，也就是黃色標(biāo)記的序列，其中含有多個(gè)GC的重復(fù)序列。當(dāng)改變離子濃度時(shí)，該區(qū)域就會(huì)伸展成為左旋結(jié)構(gòu)。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置（圓點(diǎn)）。那末只有當(dāng)復(fù)合結(jié)構(gòu)是BDNA時(shí)，才能通過能量轉(zhuǎn)移激發(fā)出熒光。當(dāng)其為ZDNA時(shí)，由于兩個(gè)基團(tuán)距離加大，從而無法實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移。圖82為B、Z型DNA轉(zhuǎn)換時(shí)其能量轉(zhuǎn)移的變化。圖81 DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)變構(gòu)示意圖 圖82 DNA轉(zhuǎn)換時(shí)其能量轉(zhuǎn)移3 近期熒光技術(shù)的新發(fā)展熒光技術(shù)發(fā)展速度很快，在DNA計(jì)算、信息學(xué)、物理學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。下面介紹幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)，希望能為DNA計(jì)算提供新的思路。（1）熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)；（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)；（4）與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)。分子信標(biāo)技術(shù)是目前較為成熟的技術(shù)，尤其是在檢測(cè)方面有著重要的應(yīng)用。但是當(dāng)檢測(cè)物很少時(shí)，分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光就不足以被檢測(cè)，甚至發(fā)生錯(cuò)誤信號(hào)。2008年，Gary K Geiss等報(bào)道了一種基因表達(dá)的多色熒光分析系統(tǒng)26。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標(biāo)記等多種技術(shù)。2005年，Ernest K. Lewis等設(shè)計(jì)了能同時(shí)激發(fā)多種熒光的方法，使得DNA檢測(cè)速度以及準(zhǔn)確度都大大提高27。2008，Jianwei Jeffery Li等提高了熒光分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度28。其原理（如圖91所示）就是先通過普通的分子信標(biāo)雜交過程，待分子雜交產(chǎn)生熒光信號(hào)后，此時(shí)，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開的分子信標(biāo)切斷，并釋放。從而，再進(jìn)行新的一輪分子信標(biāo)雜交釋放。那末熒光信號(hào)就會(huì)積累增多。在此基礎(chǔ)上，還建立了一種加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)（如圖92所示）。首先，與目標(biāo)片斷互補(bǔ)的單鏈DNA雜交，再使用連接酶進(jìn)行連接成環(huán)。隨后，利用DNA聚合酶216。29以環(huán)狀DNA為模板，加入單引物進(jìn)行PCR。在隨后擴(kuò)增的線性模板上，就含有多處目標(biāo)片斷。此時(shí)，再進(jìn)行上述的熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大。就可以大大提高信號(hào)強(qiáng)度。圖91 熒光信號(hào)積累原理 圖92 加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大原理磁珠技術(shù)，使得DNA分子的捕捉和釋放變?yōu)榭赡?。通過DNA特異性雜交，可以特異性的獲取DNA分子。2005年，Hui Xu等就將磁珠技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合，建立新型的DNA檢測(cè)系統(tǒng)29。首先，將標(biāo)記生物素的DNA1與磁珠相結(jié)合。通過目標(biāo)DNA3，可以使DNA3相互雜交，形成復(fù)合體。在DNA3上標(biāo)記有熒光集團(tuán)。通過磁珠分離，將捕獲的DNA2和目標(biāo)DNA3洗脫。由于DNA分子本省帶有負(fù)電荷，于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯（被標(biāo)記有特殊基團(tuán)）吸附。此時(shí)就會(huì)產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移，從而產(chǎn)生熒光，并被檢測(cè)（如圖10所示）。圖10與磁珠技術(shù)相結(jié)合的DNA檢測(cè)熒光技術(shù)原理DNA的構(gòu)象會(huì)隨著PH值的變化而改變。利用這一特性，2005年，DongSheng Liu等構(gòu)建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。整個(gè)裝置是由DNA寡核苷酸陣列構(gòu)成的。在每個(gè)寡核苷酸的5’端標(biāo)記有SH，隨后是由CCCC4個(gè)胞嘧啶組成的DNA序列，在3’端標(biāo)記有若丹明綠色熒光基團(tuán)。每個(gè)DNA寡核苷酸被固定在金表面。當(dāng)PH值較低時(shí)（49之間），有些胞嘧啶會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，從而與其他胞嘧啶產(chǎn)生分子間非經(jīng)典配對(duì)。此時(shí)，寡核苷酸鏈就會(huì)形成蜷縮狀結(jié)構(gòu)，而不會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交（如圖111所示）。在這種狀態(tài)下，熒光集團(tuán)非?？拷鸨砻妫s1nm），此時(shí)就不能被激發(fā)光激發(fā)。隨著PH值的增大，胞嘧啶質(zhì)子化程度降低，其分子間非經(jīng)典配對(duì)也隨之降低。若加入互補(bǔ)鏈，在金表面，展開的寡核苷酸會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交，使得寡核苷酸3’端的熒光集團(tuán)遠(yuǎn)離金表面（約8nm）。當(dāng)有激發(fā)光激發(fā)時(shí)，就會(huì)產(chǎn)生綠色熒光，實(shí)驗(yàn)還證實(shí)這種熒光的變化是可逆的。通過控制PH值，可以有效地進(jìn)行熒光變化。圖111 原理圖圖112 隨著PH值熒光可逆地進(jìn)行變化?！：；b：；ｃ：；ｄ：； 與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù) miRNAs在真核生物的調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。但是miRNAs的含量很低，檢測(cè)起來比較困難。結(jié)合DNA寡核苷酸微列陣技術(shù)、熒光技術(shù)、酶切、酶聯(lián)技術(shù)，2004年P(guān)eter T Nelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測(cè)miRNAs的方法31。首先建立寡核苷酸微列陣。每個(gè)寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數(shù)個(gè)胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補(bǔ)序列。將寡核苷酸鏈5’端共價(jià)連在芯片玻璃表面。其次，當(dāng)miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時(shí)，用核酸外切酶Ⅰ處理，將沒有特異性雜交上miRNAs的寡核苷酸鏈降解。此時(shí)保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。與此同時(shí)，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價(jià)連接有生物素的dATP進(jìn)行擴(kuò)增。最后，加入共價(jià)連接有熒光基團(tuán)的鏈合霉素，使其與連接有生物素的DNA鏈結(jié)合。通過激發(fā)熒光，保留下來的、并被擴(kuò)增了的寡核苷酸區(qū)域就會(huì)發(fā)出熒光。其熒光量的多少，還能顯示該miRNAs量的多少。圖12 RAKE原理示意圖4 展望在生物技術(shù)高速發(fā)展的今天，DNA計(jì)算的研究也是日新月異。近年