【正文】 A分子；雜交 1 引言DNA由于其具有的特性，在大自然的進化中，被選擇為穩(wěn)定的遺傳物質(zhì)。（4）與miRNAs檢測相結(jié)合的熒光技術(shù)。（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（6）與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（4）與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門。（2）與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測。本文圍繞DNA計算和熒光標記技術(shù)兩個方面進行說明。DNA計算中熒光技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展張成 楊靜 王淑棟 (北京大學信息科學技術(shù)學院，高可信度軟件技術(shù)教育部重點實驗室，北京 100871)摘要：DNA計算作為前沿科學研究的重點和熱點，已經(jīng)從簡單發(fā)展為復(fù)雜，從理論轉(zhuǎn)化為應(yīng)用。在這一過程中，反應(yīng)速度快，變化靈敏的熒光標記技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。一方面，對近年來DNA計算中熒光技術(shù)的應(yīng)用進行了總結(jié)：（1）熒光標記的表面計算。（3）與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)。（5）與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)。另一方面，介紹了幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)：（1）熒光信號識別放大技術(shù)。（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。在今后的研究中，只有將這兩者緊密結(jié)合，才能發(fā)揮DNA計算天然的優(yōu)勢。在細胞中，DNA精細地編碼并控制著整個細胞的新陳代謝。因此，DNA作為計算工具有著得天獨厚的優(yōu)勢1,2。然而伴隨著DNA計算解決問題的規(guī)模增大和形式多樣化，求解過程中DNA分子數(shù)量急劇增加以及DNA分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜性的加大，求解過程中實驗過程繁瑣且存在誤差，使得DNA計算中解的標記和檢測變得更加困難4。熒光是指某些物質(zhì)受到某種波長的光激發(fā)后，其原子中的電子被激發(fā)到較高能級，產(chǎn)生的發(fā)射光。在激發(fā)態(tài)時，這種結(jié)構(gòu)具有穩(wěn)定性，可以持續(xù)數(shù)秒鐘，從而有利于能量的轉(zhuǎn)移5。熒光標記DNA簡單便捷，可以實時檢測，而且靈敏度非常高，這些特點都使得其在DNA計算中具有廣泛的應(yīng)用前景。熒光技術(shù)在DNA計算中的應(yīng)用主要有如下幾類：（1）熒光標記的表面計算：通過DNA固定化和雜交技術(shù)，在固相表面通過熒光標記進行計算。（3）與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)：巧妙利用DNA分子的三鏈甚至多鏈結(jié)構(gòu)，通過加入引發(fā)鏈，來釋放另一DNA鏈。（5）與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)：在DNA自組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了熒光標記技術(shù)。近年來，熒光技術(shù)不僅應(yīng)用于生物學本身，而且在DNA計算、信息學等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。（2）與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)。（4）與miRNAs檢測相結(jié)合的熒光技術(shù)。2 DNA計算中熒光技術(shù)的應(yīng)用DNA表面計算其基本原理是：通過DNA固定化和雜交技術(shù)，將代表所有可能存在解的不同DNA序列固定在固相表面，然后通過多次的雜交以及降解過程來篩選正解。2002年，Adleman組使用雜交池完成了一個20個變量的3可滿足性問題6。同年，Kristiane A. Schmidt等利用單分子雜交熒光標記技術(shù)4個變量的可滿足性問題9。由于該問題共有16種可能性，故將代表著不同可能解的DNA片段固定在固相表面。那末，被雜交的固定DNA鏈變?yōu)殡p鏈，而未互補的單鏈DNA則被核酸外切酶Ⅰ降解。該實驗中，熒光技術(shù)主要應(yīng)用在解檢測的過程中：使用一條生物素標記的引物和另一條熒光標記的引物，以固相表面所有可能解的DNA片段為模版，進行PCR。將這些ssDNA與經(jīng)過多次雜交篩選的固相雜交，只有哪些存留在固相表面的DNA鏈可以雜交上，于是特定的位置就可以檢測到較高熒光強度。其實就是利用某些酶與DNA分子空間結(jié)構(gòu)的相互作用，再結(jié)合熒光技術(shù)來共同實現(xiàn)的。其最大的優(yōu)點就是巧妙地將酶的生物特性與計算問題相結(jié)合，極大地豐富了DNA計算的手段。通過上述核酸外切酶的方法，利用新技術(shù)完成單鏈DNA的解的檢測。此時右側(cè)探針由兩部分組成：一部分是和目標序列形成雙鏈的；另一部分則是由非互補的5’端DNA鏈組成（見圖2A）。恰恰在這重合的位置，可以形成酶切位點。利用這一原理，結(jié)合熒光技術(shù)，如圖所示，將熒光基標記在非互補DNA鏈的5’端，而將熒光淬滅基標記在重合的酶切位點3’端方向（見圖2B）。這種方法可以有效檢測目的片斷是否存在。圖2 實驗原理示意圖 圖3 幾種邏輯門的構(gòu)成示意圖Milan 。這種酶識別的DNA底物要求具有特殊結(jié)構(gòu)（如3a圖所示）。將寡核苷酸兩端分別標記熒光淬滅基（如羅丹明）和熒光基，那末只有寡核苷酸探針被切斷釋放，熒光基才能有效激活并釋放熒光。構(gòu)建有效的空間位阻是實現(xiàn)這個檢測手段的關(guān)鍵。基于以上原理，構(gòu)建出以下幾種邏輯門：YES型、NOT型、AND型和ANDANDNOT型。其判斷過稱為加入i1，熒光輸出。當加入i6時，環(huán)狀結(jié)構(gòu)打開，熒光結(jié)合的寡核苷酸探針無法結(jié)合在互補區(qū)域，于是無熒光輸出。AND型邏輯門（圖d所示）實際上是將兩個YES型邏輯門組裝在一起。ANDANDNOT型邏輯門（圖e）是更為復(fù)雜的組合體。然而，只要有i6存在，就不會輸出熒光。考察所有的邏輯情況后，將所有可能的邏輯門都提前置于棋盤的網(wǎng)格中。 與DNA鏈置換相結(jié)合的熒光技術(shù)該技術(shù)多用來構(gòu)建DNA邏輯門。在邏輯計算中，這種技術(shù)具有循環(huán)性、自引發(fā)性、反饋性、靈敏性和準確性等特點。2000年，Bernard Yurke構(gòu)建了一種DNA鏈置換機器，在置換過程中可以實現(xiàn)閉合式運動12。JongShik Shin等利用可反復(fù)的DNA鏈置換，構(gòu)建了可以反復(fù)讀取和輸入的三狀態(tài)存儲器14。2006年，Simon J. Green等用莖環(huán)結(jié)構(gòu)實現(xiàn)了DNA鏈的粘貼互換16。2007年,suvir venkataraman等實現(xiàn)了通過DNA鏈自粘貼來完成多段DNA聚合延伸18。2006年，Georg seelig 等報道了一種沒有酶參與的DNA邏輯門19。此時，由于Gin一側(cè)末端和G的一側(cè)單鏈末端互補，從而使邏輯門中的G寡核苷酸鏈被釋放，與Gin形成互補雙鏈。然后再加入Fin寡核苷酸鏈，F(xiàn)in的一側(cè)末端與F中間有互補序列，加之Eout本身形成的是單鏈環(huán)狀的不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，于是，F(xiàn)和Fin結(jié)合成雙鏈。文中使用了熒光標記地對Eout的釋放情況進行了檢測（如圖42所示）。當其互補結(jié)構(gòu)存在時，熒光恰被淬滅，從而無法檢測。上述由G、Eout、F的DNA互補結(jié)構(gòu)就可以構(gòu)成與門。值得注意的是，文章并不只是提出這種DNA計算邏輯門，而是將其應(yīng)用到生物基因檢測的中。圖41鏈置換原理示意圖 圖42熒光標記原理示意圖2008年，Peng Yin等對這種DNA自粘貼、鏈置換進行了更為精細的研究20。如圖51所示，莖環(huán)結(jié)構(gòu)A是由at、a、b、bt、ct、c等DNA序列構(gòu)成的，在莖環(huán)結(jié)構(gòu)末端有未互補的單鏈DNA區(qū)域。因此，當體系中只加入A、B這兩種莖環(huán)結(jié)構(gòu)時，相互之間無任何影響。I先和A末端互補，使得A的莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開。當B完全打開后，B的a*區(qū)域會與I競爭A的a區(qū)域形成互補結(jié)構(gòu)。 在上述基礎(chǔ)之上，Peng Yin等設(shè)計了多種復(fù)雜結(jié)構(gòu)的實驗：直線型、回路型、支架型、自動位移型（見圖52）。回路型指參與的激發(fā)物在循環(huán)結(jié)束后又被釋放，從而再次作用于系統(tǒng)。支架型指在整個觸發(fā)過程中，不僅是線性的作用方向，而且是向二維平面的擴展。在這些實驗中，熒光技術(shù)發(fā)揮了重要的作用。只有莖環(huán)結(jié)構(gòu)打開，才能夠檢測到相應(yīng)的熒光。尤其是在自動位移型實驗中，通過檢測熒光，可以得知特定DNA序列在特定時間移動的位置。這種技術(shù)將DNA計算和基因表達、疾病診療有機的結(jié)合在一起，為DNA計算的應(yīng)用指出了另一方向21。這些RNA很快就可以被酶解為小片段，并與相關(guān)的蛋白質(zhì)形成復(fù)合體。keller等利用載體序列的線形串聯(lián)排列以及基因表達的調(diào)控原理（非翻譯區(qū)UTR對下游基因轉(zhuǎn)錄的影響），構(gòu)建了多個邏輯門模型。這兩個mRNA只要有一個正常轉(zhuǎn)錄表達，就會有熒光蛋白輸出。（2）與門，如圖61b所示，Target A、Target B序列是串聯(lián)分布。那末只有同時加入A、B時，才能完全抑制RNAi作用，也就是說，此時熒光蛋白才能正常表達。（3）非門，如圖61c所示，假設(shè)內(nèi)源物A對siRNANOT（A）有激活作用。將這些