【正文】 e methods, 2004, 1(2)Development and application of fluorescence technology in DNA putingZHANG Cheng YANG Jing WANG Shu Dong (School of Electronic Engineering and Computer Science, Key laboratory of High Confidence Software Technologies, Ministry of Education, Peking University, Beijing 100871)Abstract: DNA puting, as a focus of scientific fields, has developed from simple to plex, from theory to application. In this course, the fluorescence, which can be handled easily and has a sensitive respond, plays an important role. This paper pays more attentions to DNA puting and fluorescence. On one hand, major applications of fluorescence in DNA puting were summed up. There are several aspects: (1) surface puting labeled by fluorescence. (2) The fluorescence detecting bined with enzyme cutting. (3) The fluorescence technology used in DNA hybridization and releasing. (4) The fluorescence logical gate based on RNAi. At first, the expression of fluorescence proteins is controlled by RNAi. (5) The fluorescence technology used in DNA selfassembly. (6) The fluorescence technology based on DNA transforming. On the other hand, several novel methods of fluorescence were introduced as following: (1) Signal amplification of fluorescence molecular beacons. (2) The fluorescence technology associated with magnetic beads. (3) The fluorescence technology changing with PH. (4) Detecting miRNAs with fluorescence technology. Only bine these two aspects into whole, most of the advantages of DNA puting can be taken used entirely.Key words: DNA puting。一方面，應該關注熒光技術與其他生物技術（如基因芯片技術、磁珠技術等）最新的發(fā)展和聯系；另一方面，必須深刻的認識和了解計算科學所亟需解決的重要問題。同時，熒光技術在DNA計算的應用也拓寬了其自身應用領域。而熒光技術的單個分子標記，熒光激發(fā)和湮滅性質，及其實時超高靈敏性檢測都表明其在DNA計算中的天然優(yōu)勢。對于DNA計算這種精細化、定量化、復雜化的發(fā)展，熒光技術的種種特性都可以滿足并適用于DNA計算的發(fā)展。熒光技術作為一種生物技術，其發(fā)展較早，且應用廣泛。DNA計算一直是世界科研領域的研究重點和熱點。圖12 RAKE原理示意圖4 展望在生物技術高速發(fā)展的今天，DNA計算的研究也是日新月異。通過激發(fā)熒光，保留下來的、并被擴增了的寡核苷酸區(qū)域就會發(fā)出熒光。與此同時，使用DNA聚合酶Klenow，以miRNAs為引物，以保留下來的寡核苷酸鏈為模板，再加入共價連接有生物素的dATP進行擴增。其次，當miRNAs特異性雜交在寡核苷酸上時，用核酸外切酶Ⅰ處理，將沒有特異性雜交上miRNAs的寡核苷酸鏈降解。每個寡核苷酸由三部分組成：支架序列、數個胸腺嘧啶、特異性miRNAs的互補序列。結合DNA寡核苷酸微列陣技術、熒光技術、酶切、酶聯技術，2004年Peter T Nelson等發(fā)明了一種稱為RAKE的檢測miRNAs的方法31?！：；b：；ｃ：；ｄ：； 與miRNAs檢測相結合的熒光技術 miRNAs在真核生物的調控中發(fā)揮著重要的作用。通過控制PH值，可以有效地進行熒光變化。若加入互補鏈，在金表面，展開的寡核苷酸會與互補鏈雜交，使得寡核苷酸3’端的熒光集團遠離金表面（約8nm）。在這種狀態(tài)下，熒光集團非?？拷鸨砻妫s1nm），此時就不能被激發(fā)光激發(fā)。當PH值較低時（49之間），有些胞嘧啶會發(fā)生質子化，從而與其他胞嘧啶產生分子間非經典配對。在每個寡核苷酸的5’端標記有SH，隨后是由CCCC4個胞嘧啶組成的DNA序列，在3’端標記有若丹明綠色熒光基團。利用這一特性，2005年，DongSheng Liu等構建了一種隨PH值變化的DNA熒光裝置30。此時就會產生能量轉移，從而產生熒光，并被檢測（如圖10所示）。通過磁珠分離，將捕獲的DNA2和目標DNA3洗脫。通過目標DNA3，可以使DNA3相互雜交，形成復合體。2005年，Hui Xu等就將磁珠技術與熒光技術相結合，建立新型的DNA檢測系統(tǒng)29。圖91 熒光信號積累原理 圖92 加強型熒光分子信標信號放大原理磁珠技術，使得DNA分子的捕捉和釋放變?yōu)榭赡?。此時，再進行上述的熒光分子信標信號放大。29以環(huán)狀DNA為模板，加入單引物進行PCR。首先，與目標片斷互補的單鏈DNA雜交，再使用連接酶進行連接成環(huán)。那末熒光信號就會積累增多。其原理（如圖91所示）就是先通過普通的分子信標雜交過程，待分子雜交產生熒光信號后，此時，加入特異的缺刻DNA酶，即將因雜交而展開的分子信標切斷，并釋放。2005年，Ernest K. Lewis等設計了能同時激發(fā)多種熒光的方法，使得DNA檢測速度以及準確度都大大提高27。2008年，Gary K Geiss等報道了一種基因表達的多色熒光分析系統(tǒng)26。分子信標技術是目前較為成熟的技術，尤其是在檢測方面有著重要的應用。下面介紹幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術，希望能為DNA計算提供新的思路。圖82為B、Z型DNA轉換時其能量轉移的變化。那末只有當復合結構是BDNA時，才能通過能量轉移激發(fā)出熒光。當改變離子濃度時，該區(qū)域就會伸展成為左旋結構。在每個連接的轉折處都由4的相連的T組成。如圖81所示的DNA復合結構是由三條鏈組成的。BDNA就是我們所熟悉的右手螺旋結構。1999年，Mao等構建了一種基于DNA分子變構的納米裝置25。隨著DNA分子的變構，其熒光強度也隨之變化。在該實驗中，利用熒光信號增減可以有效地檢測DNA納米裝置的空間變化。當加入“鑰匙”DNA鏈時，盒子蓋打開，兩個熒光分子分開。圖71 環(huán)鏈結構組成 圖72熒光段寡核苷酸和凝血酶標記的環(huán)鏈 圖73 DNA盒子蓋開閉示意圖2009年Ebbe S. Andersen等巧妙地將DNA熒光技術應用在檢測納米裝置開啟和閉合24。同時，還對環(huán)套結構進