【正文】 行了類似的雙熒光探針雜交，結(jié)果發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了熒光共振能量轉(zhuǎn)移。在電鏡下，可以觀察到柱狀熒光條帶。除了上述電鏡檢測外，Yossi Weizmann等還利用熒光技術(shù)進行了一系列實驗。在此基礎(chǔ)上，還設(shè)計了將DNA環(huán)分別固定在兩個金微粒（）上，然后利用內(nèi)切酶進行切割分離的實驗。另外，將一個環(huán)狀寡核苷酸固定在有金包被的AFM電鏡感應(yīng)頭上，而與其有互補序列的寡核苷酸則被固定在鍍有金的玻璃板上。首先，利用DNA分子互補，將兩環(huán)相接觸部分的DNA序列設(shè)計為互補，雜交后再經(jīng)連接酶連接，就形成了穩(wěn)定的環(huán)鏈結(jié)構(gòu)。這些三維結(jié)構(gòu)不僅僅包含有圖像、結(jié)構(gòu)信息，而且還能隨著結(jié)構(gòu)的變化應(yīng)用于納米技術(shù)、藥物載體、DNA計算等方面。從自組裝結(jié)構(gòu)上分，自組裝可分為一維線段結(jié)構(gòu)、二維平面結(jié)構(gòu)和三維立體結(jié)構(gòu)。圖62 二層邏輯門示意圖 與DNA自組裝立體結(jié)構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)DNA自組裝是近期發(fā)展迅速的領(lǐng)域，也是具有應(yīng)用前景的領(lǐng)域。mRNA1和mRNA2的表達都下降才能最大限度地減少LacⅠ抑制子的表達，從而減小LacⅠ抑制子對熒光蛋白的表達抑制。而二層邏輯門是指首先調(diào)控一級蛋白質(zhì)產(chǎn)物，再由一級蛋白質(zhì)來調(diào)控二級熒光蛋白基因的表達。圖61 RNAi邏輯門示意圖 在上述一步完成的RNAi邏輯門的基礎(chǔ)上，還構(gòu)建了二層邏輯門。首先確定A、B、C、E與各個siRNA之間的關(guān)系，如：加入A抑制siRNAA，促進siRNANOT（A）。當(dāng)加入A后，將會抑制TargetNOT（A）的表達，此時直接導(dǎo)致熒光蛋白產(chǎn)物的減少。因此A和B形成“與”的關(guān)系。假設(shè)有A、B兩種內(nèi)源物分別抑制siRNAA和siRNAB對TargetA、B的影響。因此，形成了“或”的關(guān)系。（1）或門，如圖61a所示，mRNA1和mRNA2分別與熒光蛋白基因串聯(lián)。于是，這種復(fù)合體就可以根據(jù)RNA來識別特定的mRNA，從轉(zhuǎn)錄水平消除特定基因。RNAi技術(shù)是近年來發(fā)展起來的特異性沉默基因技術(shù)，其基本原理就是將想敲除的基因序列或者部分序列構(gòu)建到特定載體中，經(jīng)過轉(zhuǎn)錄，形成部分序列的反義RNA（還可以通過直接加入特異的反義短寡核苷酸進行基因敲除）。圖51 莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA置換原理 回路型直線型自動位移型 支架型圖52 幾種復(fù)雜類型：直線型、回路型、支架型、自動位移型 與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門2007年，keller等創(chuàng)造性地使用活體細胞，利用RNAi技術(shù)，通過控制特異基因的表達，構(gòu)建多重邏輯門。根據(jù)標(biāo)記不同的熒光，可以了解整個循環(huán)的反應(yīng)速度，和反應(yīng)程度。其中主要是將熒光基標(biāo)記在莖環(huán)的一端，另一端則標(biāo)記有熒光淬滅基。自動位異型則是用鏈置換實現(xiàn)了特定DNA序列的位移。并且構(gòu)建了多個循環(huán)相互鑲嵌的復(fù)雜體系。直線型指I與A、B、C組件是逐級觸發(fā)，形成串聯(lián)關(guān)系。被置換掉的I就可以重新激發(fā)新的循環(huán)。此時，A的Bt區(qū)域與B的Bt*相互作用，使得B的莖環(huán)打開。但是，當(dāng)體系中加入了寡核苷酸鏈I后，就觸發(fā)了整個循環(huán)。如果加入與末端單鏈DNA互補的序列，整個莖環(huán)結(jié)構(gòu)就會打開（圖中的at與at*可以互補，其它同理）。其主要原理是利用DNA莖環(huán)結(jié)構(gòu)的鏈置換。在鼠腦總RNA中，成功的檢測了數(shù)個基因的表達情況。也就是說，只有同時加入Gin和Fin，才能誘發(fā)釋放出熒光。但是，當(dāng)Eq和Ff分離時，熒光就被釋放出來，從而表明DNA鏈的分離情況。Eq末端標(biāo)記有熒光基，而Ff末端標(biāo)記有熒光淬滅基。Eout寡核苷酸鏈被釋放。此時的互補結(jié)構(gòu)中，只剩下了寡核苷酸鏈Eout和F。其基本原理如圖41所示，即先構(gòu)建好由寡核苷酸鏈G、Eout、F共同雜交組成的DNA互補結(jié)構(gòu)，再加入Gin寡核苷酸鏈。下面介紹兩個具有代表性的工作。2007年，David Yu Zhang等實現(xiàn)了DNA鏈置換的循環(huán)進行17。2006年，Georg Seelig等對DNA鏈相互粘貼、置換的幾種模式進行了實驗15。2003年，B. Yurke等構(gòu)建了一種基于DNA鏈置換的納米機器13。近年來在science等高水平科研雜志上都發(fā)表了大量系列工作，而且在生物檢測領(lǐng)域具有廣泛的實際應(yīng)用前景。其巧妙利用DNA分子的粘貼，通過加入引發(fā)鏈，來釋放另一DNA鏈。再將代表棋子的寡核苷酸分別放入，然后觀察熒光輸出情況進行判斷。文中解決的問題是在33的棋盤中完成3個棋子同線相連。必須同時加入i1和i3，才能輸出熒光。也就是說，只有當(dāng)i1和i6都被加入時，才能有熒光輸出。其判斷過程為加入i6，熒光輸出停止。NOT型邏輯門（圖c所示）。YES型邏輯門（圖3b所示），當(dāng)i1寡核苷酸加入時，消除原來i1環(huán)狀結(jié)構(gòu)，從而標(biāo)記的熒光探針可以與之結(jié)合，并且被切除釋放。當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使綠色標(biāo)記的位阻消失的時候，加速酶切反應(yīng)；當(dāng)寡核苷酸探針的結(jié)合使紅色標(biāo)記的位阻消失的時候，降低酶切反應(yīng)。這是MAYA游戲進行邏輯判斷的主要檢測手段。只有當(dāng)上部寡核苷酸探針與E6的支架區(qū)互補，上部寡核苷酸才能被切斷釋放。這是一種利用特殊的DNA酶E6（一種依賴于DNA的RNA酶）構(gòu)建起來的邏輯門11。文中還將PCR方法檢測目的片斷與這種熒光檢測法進行了對比，發(fā)現(xiàn)該方法比PCR檢測具有更高的靈敏度。這樣，只要酶切位點被酶切，標(biāo)記有熒光基的非互補的5’端DNA鏈就會被釋放，從而與熒光淬滅基分離，使得熒光釋放量大大提高。因此，非互補的5’端DNA臂可以被切割而釋放。此時該非互補的5’端DNA臂會覆蓋在上游寡核苷酸鏈上，與左側(cè)探針至少有一個重合的堿基。其基本思想如下：左側(cè)DNA探針的3’端至少和右側(cè)雜交的DNA探針有一個堿基的重合，并使得右側(cè)探針有5’端呈單鏈狀態(tài)。2001年，Wang等在上述表面計算實驗的基礎(chǔ)上對解的檢測又進行了新的改進，即將酶切和熒光技術(shù)相結(jié)合10。這種方法具有靈敏度高，反應(yīng)速度快等特點。 圖11 實驗示意圖 圖12 列陣熒光檢測結(jié)果 與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測利用酶與DNA分子的特性，通過檢測酶切后熒光量進行計算。利用磁珠將PCR雙鏈產(chǎn)物吸附，再分離雙鏈，分離出熒光標(biāo)記的ssDNA。通過數(shù)次操作，存在于固相表面的DNA鏈就是每次經(jīng)雜交而保留下來的DNA鏈，也就是代表正解的DNA鏈。在每一次的雜交篩選過程中，加入與固定DNA鏈特異性互補的DNA。下面以2000年，Liu 等發(fā)表在nature上的DNA表面計算經(jīng)典實驗為例，說明其解決SAT問題的過程7。2004年XingPing Su等在2000年Liu7的工作基礎(chǔ)上，設(shè)計了一種通用型的DNA表面計算模型8。通過熒光標(biāo)記可以檢測每次和最終計算的結(jié)果。相信隨著DNA計算和熒光技術(shù)的發(fā)展，這兩者必將緊密結(jié)合，使得DNA計算的種類和方法更加多樣和成熟。（3）與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù)。下面有幾種近年來發(fā)展起來的新型熒光技術(shù)：（1）熒光信號識別放大技術(shù)。（6）與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)：通過DNA分子的不同狀態(tài)，構(gòu)建了可控的熒光納米裝置。（4）與基因沉默技術(shù)相結(jié)合的熒光DNA邏輯門：利用RNAi技術(shù)控制表達熒光蛋白，從而構(gòu)建了多重邏輯門。（2）與某些酶切技術(shù)相結(jié)合的熒光檢測：利用特定酶與DNA分子的特性，通過檢測酶切后熒光量進行計算。目前，結(jié)合熒光技術(shù)的DNA計算已經(jīng)成為前沿研究熱點。DNA熒光技術(shù)在生物學(xué)領(lǐng)域中已經(jīng)有很多應(yīng)用，如近年來發(fā)展起來的DNA熒光標(biāo)記、realtime檢測技術(shù)、分子信標(biāo)技術(shù)等。熒光物質(zhì)分子都具有剛性結(jié)構(gòu)和共平面的ππ共軛體系。為了解決這一難題，熒光技術(shù)在DNA計算中逐漸得到了廣泛的應(yīng)用。近年來，DNA計算領(lǐng)域發(fā)展迅速，尤其在DNA分子自組裝、DNA納米裝置等方面3。另一方面，DNA分子容易構(gòu)成二級甚至三級結(jié)構(gòu)。關(guān)鍵詞：DNA計算；熒光標(biāo)記技術(shù)；納米技術(shù)；DN