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dna計(jì)算中熒光技術(shù)的應(yīng)用及其發(fā)展-閱讀頁(yè)

2025-07-14 08:01本頁(yè)面
  

【正文】 簡(jiǎn)單的邏輯門組合起來,就可以實(shí)現(xiàn)復(fù)雜的邏輯運(yùn)算,如(A AND C AND E) OR(NOT(A) AND B),見圖61d。當(dāng)A、B、C、E共同作用時(shí),就可以根據(jù)基因排列的線性關(guān)系自動(dòng)進(jìn)行邏輯判斷。所謂一步完成是指加入的siRNA直接發(fā)生作用,降低熒光基因的表達(dá)。如圖a所示,構(gòu)建了AND運(yùn)算邏輯門。這種多層邏輯門與細(xì)胞內(nèi)的蛋白、基因調(diào)控極為相似,因此在疾病診療方面有著廣闊的應(yīng)用前景。其涉及編碼、雜交、空間結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)等多個(gè)方面。在DNA自組裝結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上,結(jié)合熒光標(biāo)記技術(shù),發(fā)展了很多精巧的DNA三維結(jié)構(gòu),如2008年Russell P Goodman等構(gòu)建的四面體,其邊還可以產(chǎn)生熒光標(biāo)記的可伸縮莖環(huán)22。2008年Yossi Weizmann等的工作是將DNA自組裝和熒光技術(shù)緊密結(jié)合的一個(gè)例子23。通過AFM電鏡檢測(cè),也能夠看到環(huán)鏈結(jié)構(gòu)的存在。當(dāng)雜交并且被連接后,其感應(yīng)力較未被連接有了顯著提高,側(cè)面說明環(huán)套結(jié)構(gòu)的存在。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,這些操作都可以在環(huán)套結(jié)構(gòu)上成功實(shí)現(xiàn)。首先,如圖A所示,將四甲基羅丹明標(biāo)記在短寡核苷酸上,通過雜交,形成環(huán)套和多個(gè)短寡核苷酸復(fù)合物。然后,使用四甲基羅丹明標(biāo)記的凝血酶,當(dāng)凝血酶結(jié)合在環(huán)套的側(cè)面時(shí),利用AFM電鏡就可以觀察到熒光條狀DNA,并伴有多節(jié)膨大結(jié)構(gòu)。因?yàn)橹挥挟?dāng)兩個(gè)熒光基和淬滅基的距離小于5nm時(shí),才會(huì)出現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移,因此,也說明環(huán)套結(jié)構(gòu)是有序排列存在的。為了檢測(cè)DNA分子納米盒子的蓋子的開閉,分別在蓋子和盒體上標(biāo)記了Cy3和Cy5熒光染料(見圖73)。此時(shí),Cy3的熒光信號(hào)增加,而Cy5熒光信號(hào)下降。 與DNA變構(gòu)相結(jié)合的熒光技術(shù)通過DNA分子的不同狀態(tài),構(gòu)建可控的熒光納米裝置。因此,通過檢測(cè)熒光強(qiáng)度就可以知道DNA分子的構(gòu)象變化。其應(yīng)用的原理就是B、Z型DNA的相互轉(zhuǎn)換。但是,對(duì)于含有多個(gè)GC的重復(fù)序列,當(dāng)離子濃度發(fā)生變化時(shí),就會(huì)伸展為左旋結(jié)構(gòu)。其中,藍(lán)色的兩條鏈相同。在這個(gè)復(fù)合結(jié)構(gòu)的中部,也就是黃色標(biāo)記的序列,其中含有多個(gè)GC的重復(fù)序列。將熒光發(fā)射基和接收基固定在如下所示位置(圓點(diǎn))。當(dāng)其為ZDNA時(shí),由于兩個(gè)基團(tuán)距離加大,從而無(wú)法實(shí)現(xiàn)能量轉(zhuǎn)移。圖81 DNA復(fù)合結(jié)構(gòu)變構(gòu)示意圖 圖82 DNA轉(zhuǎn)換時(shí)其能量轉(zhuǎn)移3 近期熒光技術(shù)的新發(fā)展熒光技術(shù)發(fā)展速度很快,在DNA計(jì)算、信息學(xué)、物理學(xué)等諸多領(lǐng)域具有很大的應(yīng)用潛力。(1)熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù);(2)與磁珠技術(shù)相結(jié)合的熒光技術(shù)(3)與PH值變化相結(jié)合的DNA熒光技術(shù);(4)與miRNAs檢測(cè)相結(jié)合的熒光技術(shù)。但是當(dāng)檢測(cè)物很少時(shí),分子信標(biāo)產(chǎn)生的熒光就不足以被檢測(cè),甚至發(fā)生錯(cuò)誤信號(hào)。其中使用了固定化、探針捕捉、多色熒光標(biāo)記等多種技術(shù)。2008,Jianwei Jeffery Li等提高了熒光分子信標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度28。從而,再進(jìn)行新的一輪分子信標(biāo)雜交釋放。在此基礎(chǔ)上,還建立了一種加強(qiáng)型熒光分子信標(biāo)信號(hào)放大技術(shù)(如圖92所示)。隨后,利用DNA聚合酶216。在隨后擴(kuò)增的線性模板上,就含有多處目標(biāo)片斷。就可以大大提高信號(hào)強(qiáng)度。通過DNA特異性雜交,可以特異性的獲取DNA分子。首先,將標(biāo)記生物素的DNA1與磁珠相結(jié)合。在DNA3上標(biāo)記有熒光集團(tuán)。由于DNA分子本省帶有負(fù)電荷,于是可以與帶有正電荷的水溶性聚乙烯(被標(biāo)記有特殊基團(tuán))吸附。圖10與磁珠技術(shù)相結(jié)合的DNA檢測(cè)熒光技術(shù)原理DNA的構(gòu)象會(huì)隨著PH值的變化而改變。整個(gè)裝置是由DNA寡核苷酸陣列構(gòu)成的。每個(gè)DNA寡核苷酸被固定在金表面。此時(shí),寡核苷酸鏈就會(huì)形成蜷縮狀結(jié)構(gòu),而不會(huì)與互補(bǔ)鏈雜交(如圖111所示)。隨著PH值的增大,胞嘧啶質(zhì)子化程度降低,其分子間非經(jīng)典配對(duì)也隨之降低。當(dāng)有激發(fā)光激發(fā)時(shí),就會(huì)產(chǎn)生綠色熒光,實(shí)驗(yàn)還證實(shí)這種熒光的變化是可逆的。圖111 原理圖圖112 隨著PH值熒光可逆地進(jìn)行變化。但是miRNAs的含量很低,檢測(cè)起來比較困難。首先建立寡核苷酸微列陣。將寡核苷酸鏈5’端共價(jià)連在芯片玻璃表面。此時(shí)保留下來的寡核苷酸上都雜交有miRNAs。最后,加入共價(jià)連接有熒光基團(tuán)的鏈合霉素,使其與連接有生物素的DNA鏈結(jié)合。其熒光量的多少,還能顯示該miRNAs量的多少。近年來,在高水平科學(xué)研究刊物上,發(fā)表了大量DNA計(jì)算方面的研究成果。DNA計(jì)算發(fā)展至今,已經(jīng)從開始的實(shí)驗(yàn)階段逐漸轉(zhuǎn)入實(shí)用階段;從單一型技術(shù)逐漸發(fā)展為多元化技術(shù);從簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)逐漸擴(kuò)增為復(fù)雜結(jié)構(gòu)。因其體積小,便于標(biāo)記,反應(yīng)速度快,變化靈敏,所以在核酸標(biāo)記和檢測(cè)方面有著得天獨(dú)厚的優(yōu)勢(shì)。比如近兩年,關(guān)于DNA鏈置換熒光技術(shù)的研究,這種鏈置換過程都屬于單分子間的變化,如果使用常規(guī)生物實(shí)驗(yàn)手段根本無(wú)法實(shí)現(xiàn)。因此,熒光技術(shù)的進(jìn)步必然推動(dòng)DNA計(jì)算的發(fā)展。這種跨學(xué)科、跨領(lǐng)域的融合貫通是推動(dòng)整個(gè)科學(xué)前進(jìn)的原動(dòng)力。只有充分的將兩個(gè)方面有機(jī)地結(jié)合,通過提出創(chuàng)造性想法,才能將DNA計(jì)算轉(zhuǎn)變?yōu)閷?shí)用、穩(wěn)定的計(jì)算手段;才能發(fā)揮DNA計(jì)算天然的優(yōu)勢(shì).參考文獻(xiàn)1. 、進(jìn)展及難點(diǎn)(Ⅲ),2007,30(6):8698802. Hao Yan. Nucleic Acid Nanotechnology. Science,306,204820493. Jonathan Bath, Andrew J. Turberfield. DNA nanomachines. nature nanotechnology, 2, 275284 4. 許進(jìn), 譚鋼軍, 范月科, 郭養(yǎng)安. DNA計(jì)算機(jī)原理_進(jìn)展及難點(diǎn)_論DNA計(jì)算機(jī)模型. 計(jì)算機(jī)學(xué)報(bào),2007,30(6):8818935. 黃曉峰,張遠(yuǎn)強(qiáng),張英起. 熒光探針技術(shù). 人民軍醫(yī)出版社,20046. Ravinderjit S. Braich, Nickolas Chelyapov, Cliff Johnson. Solution of a 20variable 3SAT problem on a DNA puter. Science, 296, 4995027. Qinghua Liu, Liman Wang, Anthony G. Frutos. DNA puting on surfaces. nature, 403, 1751798. Xingping Su, Lloyd M. Smith. Demonstration of a universal surface DNA puter. Nucleic Acids Research, 32(10), 311531239. Kristiane A. Schmidt1, Christiaan V. Henkel1, Grzegorz Rozenberg. DNA puting using singlemolecule hybridization detection. Nucleic Acids Research, 32(17), 4962496810. Liman Wang, Jeff G. Hall, Manchun Lu1. A DNA puting readout operation based on structurespecific cleavage. Nature biotechnology. 2001, 19, 1053105911. Millian N. Stojanovic , Darko stefanovic. A deoxyribozymebased molecular automaton. Nature biotechnology. 2003, 21, 1069107412. Bernard Yurke, Andrew J. Turber174。 fluorescence labeling。 DNA molecule。電話:01062759884。楊靜:女,1982年,博士研究生,DNA計(jì)算機(jī)及DNA納米技術(shù)。 Email:Yang_jing。Tel: 01062350291. Email:wangshd2008。13 /
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