【正文】 T4 DNA連接酶 高達(dá) 2022U/ul，是其它產(chǎn)品的400倍 ，因此連接效率大為提高： overnight vs 5 min（ sticky or blunt ends） 32 TA克隆 直接 重組 PCR產(chǎn)物 的簡(jiǎn)便方法。 cloning is DNA topoisomerase I, which functions both as a RE and as a ligase. *Vaccinia virus （ 牛痘病毒） topoisomerase I specifically recognises DNA sequence 5180。 TOPO TA克隆試劑盒中包括（ 整個(gè)反應(yīng)只需 五分鐘 ?。? （ 1） Topoisomerase I載體： 線性化 ， 牛痘病毒的拓?fù)洚悩?gòu)酶 I連接 在 3’ T的 P上。 該酶識(shí)別序列： 5180。 TOPO平端克隆法 ： 改良載體 把 ccdB （ Control of cell death）基因并入到 MCS中。 可 大大減少非特異性菌落，提高篩選效率。 TOPO平端克隆方法原理示意圖 但是，依然存在平端連接的共同不足：雙向插入。 3）定向克隆法（ DTOPO） 讓 載體的一端為 GTGG，同時(shí)讓 正向引物的 5’ 端 添加 CACC與載體互補(bǔ)（一粘一平），這樣就可定向插入 PCR產(chǎn)物，重組效率在 90%以上。 現(xiàn)代生物技術(shù) 是隨著重組 DNA技術(shù)的問(wèn)世而“誕生”，即實(shí)現(xiàn)了生物技術(shù)從“ 傳統(tǒng)” 向“ 現(xiàn)代”的飛躍。 它是現(xiàn)代生物技術(shù)的 核心技術(shù) 比爾 .蓋茨預(yù)言 ， 超過(guò)他的下一個(gè)首富必定出自基因領(lǐng)域； 李遠(yuǎn)哲先生 （諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)得主）在北大百年校慶時(shí)說(shuō)： 亞洲國(guó)家如果在下次經(jīng)濟(jì)騰飛中有所作為的話，生命科學(xué)技術(shù)將是可能取得 比較大的突破的一個(gè)領(lǐng)域。 4 重組 DNA技術(shù)的應(yīng)用 42 在疾病治療中的應(yīng)用 1）生產(chǎn) 重組 蛋白質(zhì) /多肽類藥物（基因工程藥物） * 它們?cè)诮M織細(xì)胞內(nèi)含 量甚微 ，常規(guī)方法提取很難滿足臨床應(yīng)用； * 利用 重組技術(shù)和生物反應(yīng)器 （大腸桿菌、酵母菌、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和植物）可以 大量生產(chǎn) ，成本低，藥效好，并且 毒副作用小 ，已經(jīng)在臨床廣泛應(yīng)用。它經(jīng)歷了 三個(gè)發(fā)展階段 ： 細(xì)菌基因工程、細(xì)胞基因工程、轉(zhuǎn)基因動(dòng) /植物生物反應(yīng)器。 **生物反應(yīng)器研究重點(diǎn)從原 /真核細(xì)胞轉(zhuǎn)向 轉(zhuǎn)基因動(dòng)/植物，如乳腺反應(yīng)器 。 目前國(guó)內(nèi)外已有上百種藥用蛋白或多肽在植物中表達(dá)（干擾素、促紅細(xì)胞生長(zhǎng)素、抗原蛋白等）。 人一鼠嵌合抗體： 將鼠源單抗的可變區(qū)與人抗體的恒定區(qū)融合而得到的抗體。 構(gòu)建嵌合抗體的大致過(guò)程：將鼠源單抗的 可變區(qū)基因 克隆出來(lái)，連到包含有 人抗體恒定區(qū)基因及表達(dá)所需的其它元件 (如啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、選擇標(biāo)記等 )的表達(dá)載體上，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞 (如骨髓瘤細(xì)胞、 CHO細(xì)胞 )中表達(dá)?？贵w的免疫原性極低，而其抗原結(jié)合能力保持不變。 FDA批準(zhǔn)的 26中抗體藥物中，利妥昔 Rituxan、英夫利昔Remicade、赫賽汀 Herceptin和阿瓦斯汀 Avastin都超過(guò)40億美元，在治療淋巴瘤、乳腺癌、結(jié)腸癌等惡性腫瘤及自身免疫病中顯示了良好的臨床療效。 3） 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物 有望 成為人體器官工廠 器官短缺的對(duì)策之一： 異種移植 豬作來(lái)源 的 優(yōu)勢(shì) ：孕期短、產(chǎn)仔多、生長(zhǎng)快，更重要的是其器官 大小與人較接近 **未經(jīng)過(guò)人源化 的豬器官會(huì)引起 排斥反應(yīng)，導(dǎo)致器官移植失敗 **對(duì)策： 通過(guò) 轉(zhuǎn)基因方法 去除 豬引起人排斥反應(yīng)的關(guān)鍵基因，培育 轉(zhuǎn)基因豬（單個(gè)生產(chǎn)） 轉(zhuǎn)基因克隆豬（批量生產(chǎn)） 我國(guó)的體細(xì)胞克隆豬問(wèn)世 ? 體細(xì)胞克隆醫(yī)用豬 ： 2022年 5月 24日在天津?qū)毜献娲N豬場(chǎng)出生，并有兩頭成功存活。 （ 2）有利于開(kāi)展 異種器官移植的研究和應(yīng)用 。 天津， 2022 42 在疾病治療中的應(yīng)用 4）基因治療 重組 DNA技術(shù)用于疾病治療的 2種方式： （ 1）基因重組藥物： 即其表達(dá)產(chǎn)物，如重組蛋白、重組抗體等； （ 2）基因本身 即通過(guò) 重組 DNA技術(shù) 構(gòu)建具有特定功能的 基因重組體 ，以之為藥物，以矯正（補(bǔ)償或抑制）功能異?；虻淖饔?。 目前，已發(fā)現(xiàn)的遺傳病有 6500多種，其中單基因病約 3000多種 第一例基因治療： 美國(guó)， 1990年 分別 4歲和 9歲的兩個(gè)小女孩由于體內(nèi) 腺苷脫氨酶缺乏 而患有嚴(yán)重的聯(lián)合免疫缺陷癥。這一開(kāi)創(chuàng)性的工作標(biāo)志著基因治療已經(jīng)從實(shí)驗(yàn)研究過(guò)渡到臨床實(shí)驗(yàn) 。 ex vivo ? 基因治療的臨床試驗(yàn)：在美國(guó)已進(jìn)行了多年，以 p53基因治療藥物的研究最多，并于 1995年批準(zhǔn)重組腺病毒 p53制品進(jìn)入臨床試驗(yàn)； ? 美國(guó)、日本、加拿大和歐洲的科學(xué)家開(kāi)展了用重組腺病毒p53制品對(duì)頭頸部鱗癌、乳腺癌、食道癌等數(shù)十種腫瘤的基因治療； ? 給藥方式：腫瘤局部注射、靜脈注射、介入給藥、胸腹腔灌注等方式； ? 國(guó)外至今沒(méi)有獲得批準(zhǔn)的基因治療藥物： 由于基因治療藥物在臨床試驗(yàn)中尚存在一些問(wèn)題， FDA和歐盟一直沒(méi)有開(kāi)綠燈。 ?商品名 “今又生”。 1） 傳統(tǒng)疫苗（第一、二代疫苗） 減毒活疫苗和死疫苗； 第 1個(gè)是炭疽病疫苗（ 1881年） 2） 重組亞單位疫苗 (subunit vaccine，第三代 ) 20世紀(jì) 70年代以來(lái) , 用 基因工程技術(shù) 生產(chǎn)的疫苗 *只含 病原體的一種或幾種抗原 ，而不含有病原體的其他遺傳信息。 優(yōu)點(diǎn)： 安全，成本低廉，廣泛應(yīng)用 例如： 最初的乙肝疫苗是 血源性乙肝疫苗，從乙肝病人血液中分離提取乙肝表面抗原制成的，造價(jià)高（純化），乙肝血液 來(lái)源受限， 潛在感染危險(xiǎn)等； 在 20世紀(jì) 80年代初將乙型肝炎病毒 (HBV)S基因的一個(gè) 835bp片段 重組 到表達(dá)載體，并在酵母中表達(dá)了 HbsAg蛋白 。 整個(gè)科研項(xiàng)目歷時(shí)十五年。但，它非重組疫苗，而是流感 裂解疫苗 ??！ 3）疫苗研發(fā) **新方向之一： 轉(zhuǎn)基因動(dòng) /植物可食疫苗，其優(yōu)勢(shì)在于 可食用性，因此，成本低（勿需純化等）、方便等。 目前已有一些編碼細(xì)菌和病毒抗原的基因在動(dòng) /植物中成功表達(dá)，并且通過(guò)口服試驗(yàn)證明了其有效性。 ? 2022年，將大腸桿菌的腸毒素 LTB基因在黃色玉米的玉米粒中定位表達(dá)、堆積，玉米粒便成為 LTB抗原蛋白“膠囊” ，使免疫效果成倍提升。 **新方向之二：基因工程活載體疫苗 ? 利用基因重組方法改造細(xì)菌和病毒，使之成為 活體重組疫苗 （ live rebinant vaccine）。 ? 其抗原的構(gòu)象與天然抗原非常相似或相同，因此免疫效力很高 。 **抗原基因 +表達(dá)載體 重組子 導(dǎo)入人體 活體細(xì)胞內(nèi) 持續(xù)表達(dá) 天然抗原 誘導(dǎo)特異性應(yīng)答，賦予人體特異免疫力。 4 重組 DNA技術(shù)的應(yīng)用 44 在臨床診斷上的應(yīng)用 1）制備 核酸探針 等用于疾病的基因診斷； 2）制備 重組抗原 ，以生產(chǎn)相應(yīng)抗體，用于診斷； 3）制備 重組抗原 ，檢測(cè)受試者是否存在其抗體； 4） 基因工程抗體： 如小分子的單鏈抗體帶上 同位素或熒光標(biāo)記 后用于腫瘤的體內(nèi) 定位顯像診斷 等 45 其它用途 基因工程牛奶 增加奶中乳鐵蛋白、溶菌酶、抗病因子和有利于吸收鈣的蛋白，降低奶中的脂肪 提高動(dòng)物食品的品質(zhì) 降低結(jié)締組織的交聯(lián)度 改善肉質(zhì)（嫩化肉質(zhì)） 用于提高奶酪產(chǎn)量： 生產(chǎn)奶酪的 凝乳酶 傳統(tǒng)上來(lái)自哺乳小牛的胃；通過(guò)重組技術(shù)， 用酵母生產(chǎn)凝乳酶 ，大量用于奶酪制造。 該菌在數(shù)小時(shí)內(nèi)清除的 浮油，天然菌要花 1年 以上的時(shí)間才能消除。 5000多年基因難題被破解 2022年日本造出藍(lán)色玫瑰 彩色蠶繭屬自然界原生品種，其開(kāi)發(fā)利用面臨的難題： 產(chǎn)量低；色澤不均勻，色彩不牢固，按常規(guī)方法加工成絲，均呈花斑狀。 基因重組 原始種優(yōu)良彩色繭基因， 轉(zhuǎn)移到 高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)的白色繭品種， 選育出 高產(chǎn)彩色繭蠶品種 。 蘇州大學(xué)蠶桑研究所 農(nóng)業(yè)科技學(xué)院蠶學(xué)系 2022年 11月 高產(chǎn)天然彩色繭蠶品種 金蠶 1號(hào) ? 西北農(nóng)林科技大學(xué)（ 20220717 ）：天然彩色繭絲品種試養(yǎng)獲成功 。 耐儲(chǔ)轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 耐儲(chǔ) 轉(zhuǎn)基因植物 瑞士金大米 煙草 石竹 棉花 熒光蘑菇 富含類胡蘿卜素 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 （ 1）基因工程微生物的 逃逸 ： 是否會(huì)產(chǎn)生某種有帶有特殊致病基因的微生物，如果它們從實(shí)驗(yàn)室逸出并且擴(kuò)散，有可能造成類似鼠疫的可怕疾病的流行。 （ 3）分子克隆技術(shù)在人類身上的應(yīng)用可能造成巨大的 社會(huì)問(wèn)題 ，并對(duì) 人類自身的進(jìn)化 產(chǎn)生影響，而應(yīng)用在其它生物上同樣具有危險(xiǎn)性，因?yàn)樗鶆?chuàng)造出的新物種有可能 具有極強(qiáng)的破壞力 而引發(fā)一場(chǎng)浩劫。 （ 5）轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù)的建立：如果被某些人用來(lái)制造 克隆人、超人、戰(zhàn)爭(zhēng)狂人等 將可能破壞整個(gè) 人類社會(huì)的和平。 在你的專業(yè)領(lǐng)域，重組 DNA技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀和潛在的新用途。 解決人類生存與發(fā)展所面臨的一系列重大問(wèn)題，在很大程度上將依賴于生命科學(xué)的發(fā)展。 你可能的貢獻(xiàn)？ 從何入手 ？ 案例 在一次香山科學(xué)會(huì)議上，有專家提出我國(guó)的倫理學(xué)原則應(yīng)該是 社會(huì)整體利益第一 。 2）正好有一個(gè)智商 20的殘疾青年，他不能自力，一生靠國(guó)家救濟(jì)，但他身體健康，五個(gè)器官結(jié)構(gòu)和功能特好，與五位院士的組織也很匹