【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 物群落多樣性。從土壤中簡(jiǎn)單提取和平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)不能得到土壤微生物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中的生活特征和生態(tài)功能的信息[22]。純培養(yǎng)方法和原理大多數(shù)是從研究有關(guān)醫(yī)用微生物的方法中引用過(guò)來(lái)的，其實(shí)有些方法對(duì)土壤微生物研究并不適合。例如在自然土壤生態(tài)環(huán)境下，許多土壤微生物處于貧營(yíng)養(yǎng)狀態(tài)，而在實(shí)驗(yàn)室通常用營(yíng)養(yǎng)豐富的牛肉汁蛋白胨來(lái)測(cè)定土壤活細(xì)菌的總數(shù)，因而大量的貧營(yíng)養(yǎng)微生物不能生長(zhǎng)，其測(cè)定結(jié)果誤差大；實(shí)驗(yàn)室在分離培養(yǎng)土壤細(xì)菌時(shí)，通常只是在28℃下培養(yǎng)，雖然土壤中存在高溫型細(xì)菌，但土壤中的低溫型細(xì)菌卻被忽視了。由于傳統(tǒng)的平板培養(yǎng)方法只能反應(yīng)極少數(shù)微生物的信息，這些結(jié)果不但不能充分反映土壤微生物生態(tài)功能，而且還埋沒(méi)了大量極有應(yīng)用價(jià)值的微生物資源。所以傳統(tǒng)的研究方法只能作為一種輔助手段，只有與其他先進(jìn)方法結(jié)合起來(lái)時(shí)才能較為客觀和全面的反映微生物群落結(jié)構(gòu)的真實(shí)信息。但這種方法適合分離具有特定功能的特殊目標(biāo)物種，利用該方法已獲得許多應(yīng)用價(jià)值的微生物種類，并應(yīng)用于基因介導(dǎo)及生態(tài)恢復(fù)等方面。 BIOLOG鑒定系統(tǒng)BIOLOG系統(tǒng)自從Garland和Miss于1991年建立起來(lái)后，廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性:不同土壤類型[23 ]、不同植物物種下的土壤[24 ]、不同管理策略下的農(nóng)業(yè)土壤[25, 26 ]和不同植被的根際土壤[27]。此方法是根據(jù)微生物對(duì)單一碳源底物的利用能力差異，當(dāng)接種菌懸液時(shí)，其中一些孔中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)被利用，使孔中的氧化反應(yīng)指示劑四氯唑紫呈現(xiàn)不同程度的紫色，從而構(gòu)成該微生物的特定指紋。經(jīng)過(guò)BIOLOG系統(tǒng)配套軟件分析，并與標(biāo)準(zhǔn)菌種的數(shù)據(jù)庫(kù)比較之后，該菌株的分類地位便被確認(rèn)出來(lái)。Biolog 法被用于多種病原微生物的鑒定和環(huán)境微生物群落的研究中。通過(guò) Biolog 法進(jìn)行環(huán)境微生物研究時(shí)無(wú)需分離培養(yǎng)純種微生物，就可獲得有關(guān)微生物群落總體活性與代謝功能的信息，最大限度地保留了微生物群落原來(lái)的代謝特征，且靈敏度高，分辨力強(qiáng)，數(shù)據(jù)的讀取與記錄都可由計(jì)算機(jī)輔助完成。但BIOLOG只能反映少數(shù)適合在微平板(microplate)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的微生物，即通過(guò)微生物群落對(duì)選擇性培養(yǎng)基或刺激物的反應(yīng)來(lái)測(cè)定代謝活性，所以不能反映實(shí)際狀態(tài)[28]。另外由于培養(yǎng)環(huán)境的改變可能引起微生物對(duì)碳底物實(shí)際利用能力的改變而造成一定的誤差，并且由于目前所擁有的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)還不完善，所以有些種類還不能被準(zhǔn)確鑒定。即使存在以上缺點(diǎn)，但由于可以快速、簡(jiǎn)便地獲得大量土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性方面的信息，仍被認(rèn)為是一種較好的方法。 磷脂脂肪酸（PLFA）分析磷酸脂肪酸是微生物結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定組成成分，分析脂肪酸的種類及組成比例可鑒別土壤微生物的多樣性。磷脂脂肪酸圖譜分析法的基本流程是:首先將磷脂脂肪酸全部提取出來(lái)，然后用氣相色譜或氣質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行分析，得出PLFA圖譜[29]。群落的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，就可通過(guò)圖譜的變化得到快速有效的監(jiān)測(cè)。使用磷脂類化合物中的脂肪酸組成估價(jià)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)是近幾十年常用的一種生化方法。磷脂類化合物只存在于所有活細(xì)胞膜中，一旦生物細(xì)胞死亡， 細(xì)胞膜很快就被降解，磷脂脂肪酸會(huì)被迅速的代謝掉，生物中的磷脂類化合物能顯示出一快速轉(zhuǎn)換率，而且生物可以含有相對(duì)固定量以磷脂類化合物形式作為它們的生物量[30]。一些學(xué)者曾發(fā)現(xiàn)使用直接從土壤中提取的磷脂類化合物的量可準(zhǔn)確地表達(dá)為土壤的微生物量[31]。磷脂類化合物的這些特征和磷脂類化合物與生物關(guān)系的密切性，決定了可用其作為土壤中微生物標(biāo)志化合物的可能性，此外，脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。因此，許多研究者用包括土壤在內(nèi)的環(huán)境樣中可提取磷脂類化合物中的脂肪酸(PLFA)組成來(lái)直接估價(jià)其微生物的群落結(jié)構(gòu)[30, 31]。PLFA方法雖然能跟蹤研究微生物群落的動(dòng)態(tài)變化，能快速有效的從環(huán)境樣品種提取大部分脂肪酸，但是也有其局限性。第一，他不能從種的水品上鑒定微生物，只能鑒定到屬；第二，這種方法依賴于標(biāo)記脂肪酸，標(biāo)記脂肪酸變化導(dǎo)致錯(cuò)誤的群落變化估計(jì)，因此操作過(guò)程需要十分小心謹(jǐn)慎，防止人為因素的干擾。第三，細(xì)菌和真菌在不同的生長(zhǎng)時(shí)期以及環(huán)境壓力下的脂肪酸含量有所變化，給監(jiān)測(cè)帶來(lái)困難[32]。分子生物學(xué)研究方法 基于分子雜交技術(shù)的分子標(biāo)記法熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)技術(shù) 環(huán)境樣品直接作原位雜交(in situ hybridization)，可以得到未知菌的微生物多樣性的大量信息，如微生物的形態(tài)特征和豐度及在樣品上的空間分布和動(dòng)態(tài)，原位雜交技術(shù)能有效對(duì)環(huán)境微生物的樣品進(jìn)行定量。如 Jain 等采用特異性的探針對(duì)地下水中的細(xì)窺進(jìn)行了原位雜交，研究了細(xì)菌有關(guān)質(zhì)粒基因的存在和分布情況。熒光原位雜交技術(shù)就像Northern、Southern印記一樣，是基于兩個(gè)寡核苷酸通過(guò)互補(bǔ)序列配對(duì)。但FISH的靶序列是留在組織中而沒(méi)有必要要像Northern、Southern技術(shù)一樣在雜交之前首先要分離核酸[33]。該方法中，整個(gè)細(xì)胞是被固定的。首先它的16S或者23SrRNA與熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸探針進(jìn)行雜交；再由掃描共焦激光顯微鏡(Scanning confocal laser microscopy，SCLM)觀察固定的細(xì)胞。由于雜交的是細(xì)胞，所以不需要提取DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增以及克隆等步驟。Gall和Pardue最早描述了熒光原位雜交技術(shù)[34]。這項(xiàng)技術(shù)最早應(yīng)用是放射性的互補(bǔ)序列作探針對(duì)DNA靶序列進(jìn)行研究。后來(lái)Manning等人首次將非放射性的原位雜交技術(shù)應(yīng)用于細(xì)胞遺傳學(xué)的研究[35]。FISH技術(shù)的應(yīng)用受到環(huán)境樣品微生物生理狀態(tài)的影響，芽孢、放線菌及休眠時(shí)期的細(xì)胞的細(xì)胞膜的通透性低，會(huì)影響群落中部分種屬豐度的錯(cuò)誤估計(jì)。而且，F(xiàn)ISH由于事先要根據(jù)已知種屬設(shè)計(jì)探針，不能檢測(cè)出環(huán)境樣品中的未知種屬[36]；但它能將單個(gè)細(xì)菌從復(fù)雜的菌群背景中檢測(cè)出來(lái)，并加以定量，所需時(shí)間很短，有望成為一種常規(guī)的簡(jiǎn)便分析方法。 基于PCR技術(shù)的DNA指紋圖譜技術(shù)PCR技術(shù)是1985年由Mullis發(fā)明的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，主要特點(diǎn)是短時(shí)間內(nèi)能在實(shí)驗(yàn)室條件下人為地控制并特異擴(kuò)增目的基因或DNA片段，使研究的目的基因及樣品中的微量微生物基因得到擴(kuò)增，為分子微生物生態(tài)學(xué)的研究提供了非常方便的手段。1990年，Ward[4]等人利用對(duì)環(huán)境微生物的16SrRNA序列分析，揭示了環(huán)境中存在大量未培養(yǎng)微生物。因此，大量基于16SrRNAPCR的分子微生物學(xué)方法被發(fā)展應(yīng)用于復(fù)雜的微生物生態(tài)研究，為微生物群落多樣性提供了圖案或輪廓，分析時(shí)有直觀、快速、高通量的特點(diǎn)。 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(Restriction fragment length polymorphism，RFLP) / 擴(kuò)增核糖體 DNA 限制性分析(Amplified ribosomal DNA restriction analysis， ARDRA) 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性( RFLP) 又叫擴(kuò)增核糖體 DNA 限制性分析(ARDRA)， 是一種基于 PCR 的分析環(huán)境微生物多樣性的方法。該技術(shù)是Bostein首先提出的一種分子遺傳標(biāo)記，是第一代以DNA指紋圖譜為基礎(chǔ)用于微生物分型鑒定的方法。其原理是根據(jù)不同生物個(gè)體或種群之間DNA片段酶切位點(diǎn)有所差異的特點(diǎn)，利用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行消化，產(chǎn)生長(zhǎng)短、種類、數(shù)目不同的限制性片段，然后對(duì)這些特定DNA片段的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物進(jìn)行分析，根據(jù)特定的限制性酶譜圖可對(duì)群落中的微生物加以區(qū)分。其主要特點(diǎn)是:(1)可以直接研究微生物種群的目標(biāo) DNA 組成，而且由于限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列具有專一性，所以用 RFLP 技術(shù)進(jìn)行多態(tài)性分析具有較高的可靠性；(2)運(yùn)用該技術(shù)時(shí)所涉及的遺傳信息較多，區(qū)分種群差異的能力更強(qiáng)，因此該方法對(duì)微生物群落多樣性，尤其是微生物的分類和鑒定具有重要意義[37, 38] 。該方法最大的缺點(diǎn)就是酶切后形成的條帶太多，不宜分析，減少限制性內(nèi)切酶的數(shù)量或選用酶切位點(diǎn)為6bp的限制性內(nèi)切酶可減少限制性片斷的數(shù)量，能提高其分辨率。另外，同一類群的微生物酶切后會(huì)產(chǎn)生幾個(gè)片斷而降低檢測(cè)靈敏性。 但是該方法工作量特別大，目前還無(wú)人對(duì)這些工作進(jìn)行重復(fù)。 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA技術(shù)(random ampliflyied pomorphic DNA, RAPD) 隨機(jī)引物擴(kuò)增多態(tài)性方法是以人工隨機(jī)合成的DNA分子為引物，以基因組DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)對(duì)多態(tài)性DNA片段隨機(jī)合成。若某一引物分子與某一片段DNA模板具有互補(bǔ)的核酸序列，該引物分子就會(huì)結(jié)合到單鏈的DNA模板上，合成一段新的互補(bǔ)DNA鏈。對(duì)整個(gè)基因組的DNA分子而言，某一引物可能會(huì)與單鏈DNA的許多位點(diǎn)結(jié)合。然后對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，用EB染色，就可以直接檢驗(yàn)出被擴(kuò)增的DNA多態(tài)性。該方法適用于微生物種間、亞種間乃至菌株間的親緣關(guān)系分析，以及未知菌株的快速鑒定等[39]。在同一地點(diǎn)重復(fù)進(jìn)行這種群落篩選的方法，就可以確定在一個(gè)特定位點(diǎn)或一個(gè)特定生態(tài)系統(tǒng)中微生物生物多樣性的變化情況[40]。與RFLP法相比，RAPD法所需的模板量少，操作快，不需要知道DNA序列信息，并且能迅速獲得基因圖譜，標(biāo)記密度較大；而且DNA樣品需要量較少，引物價(jià)格便宜，成本較低。但是RAPD法實(shí)驗(yàn)重復(fù)性較差，結(jié)果可靠性較低，一般可以通過(guò)對(duì)單鏈引物進(jìn)行篩選，優(yōu)化PCR條件來(lái)克服這一弊端。 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性(amplified fragment length polymorphism，AFLP) AFLP是PCR和RFLP技術(shù)發(fā)展的一種新型DNA指紋技術(shù)。該技術(shù)利用了RFLP的可靠性和PCR的高效性，對(duì)基因組DNA酶切片段進(jìn)行選擇性擴(kuò)增，其實(shí)就是利用2種以上的酶切割DNA形成不同酶切位點(diǎn)的限制酶切片段，在所得的酶切片段上加上雙鏈人工接頭，作為PCR擴(kuò)增的模板。AFLP對(duì)PCR的引物作了修飾，將引物與酶切片段識(shí)別序列結(jié)合起來(lái)，核心序列與人工接頭互補(bǔ)，從而實(shí)現(xiàn)選擇性擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，顯示擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性[41]。AFLP 集 RFLP 和RAPD 的優(yōu)勢(shì)為一體，既具有高的分辨力，準(zhǔn)確性和重復(fù)性，又克服了RFLP的繁瑣操作，成為遺傳多樣性檢測(cè)和系統(tǒng)分類及基因定位的主要分子標(biāo)記技術(shù)。不足之處是得到的主要是顯性，而非共顯性標(biāo)記；且AFLP引物需要用同位素標(biāo)記，操作麻煩，目前，用熒光素標(biāo)記，即熒光素標(biāo)記的擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，如對(duì)尿路菌、大腸埃希菌、空腸彎曲菌和不動(dòng)桿菌在基因水平作出了鑒定[42]。 末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)技術(shù)(terminal restriction fragment length poly morphism, TRFLP) TRFLP在技術(shù)上與RFLP相似，只是其中的一個(gè)引物的5’端用熒光物質(zhì)標(biāo)記。這樣所得的PCR產(chǎn)物的一端就帶有這種熒光標(biāo)記，再將PCR產(chǎn)物用合適的限制性內(nèi)切酶消化，由于不同菌的核苷酸序列的差異，酶切位點(diǎn)就會(huì)存在差異，酶切后就產(chǎn)生了許多不同長(zhǎng)度的限制性片段。其中帶有熒光標(biāo)記的TRFs（末端限制性酶切片段）就可以被DNA自動(dòng)測(cè)序儀檢測(cè)到，因?yàn)槊糠N菌的末端熒光標(biāo)記片段長(zhǎng)度是唯一的，所以峰值圖上的每一個(gè)峰就至少代表了一種菌，從而反映了微生物群落組成情況。通過(guò)只測(cè)定16S rDNA的TRFs，RFLP分布圖的復(fù)雜性減少并且每條可見(jiàn)的帶（片段）代表一個(gè)核型或者操作分類單元。TRFLP 有很多優(yōu)點(diǎn)，首先它不僅能對(duì)樣品進(jìn)行定性分析，還可以進(jìn)行定量分析。 其次，測(cè)試過(guò)程自動(dòng)完成并且結(jié)果以圖譜的形式表示出來(lái)[ 43, 4449 ] 。再者，PCR 的退火溫度及循環(huán)次數(shù)在一定范圍內(nèi)的變化對(duì) TRFLP 圖譜的定量定性分析的影響不大，這在一定程度上確保了實(shí)驗(yàn)的穩(wěn)定性和可重復(fù)性。該方法還因快速、靈敏而被廣泛的應(yīng)用于菌種的鑒定、各種微生物群落分析、不同樣品間相互關(guān)系的檢測(cè)、細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在時(shí)間和空間尺度上的動(dòng)態(tài)變化研究等[4449] 。TRFLP法除提取方法和 PCR 反應(yīng)的缺陷以外，引物的選擇和酶切是該方法的關(guān)鍵，因?yàn)椴煌飻U(kuò)增出的片斷不同，獲的TRFLP圖譜也會(huì)產(chǎn)生很大的差異。 用不同限制性內(nèi)切酶得到的群落指紋信息也會(huì)不同，一般情況下選擇 2個(gè)或 4個(gè)酶進(jìn)行酶切較為合適。 單鏈構(gòu)象多態(tài)性技術(shù)(singlestrand conformational polymorphism, SSCP) 該技術(shù)是將不同序列的DNA 片段變性后折疊成不同空間構(gòu)象的單鏈片段，即使是相同長(zhǎng)度的單鏈 DNA，因其順序不同或單個(gè)堿基差異，所形成的構(gòu)象也會(huì)不同。 不同構(gòu)象的 DNA 片段進(jìn)行凝膠電泳時(shí)，每條單鏈處于一定的位置，靶 DNA中若發(fā)生堿基缺失、插入或單個(gè)堿基被置換時(shí)，就會(huì)出現(xiàn)泳動(dòng)變位，從而揭示該片段中的基因變異。 該方法靈敏度較高，能檢測(cè)出核苷酸的差異，能區(qū)別群落中差異較小的種群，也可用于微生物群落演替的分析。同時(shí)可以切膠純化直接測(cè)序與GenBank上的已知序列比對(duì)，得到特異的基因序列，從而達(dá)到分類的目的。SSCP 最大的缺點(diǎn)是有些單鏈 DNA 可能形成不同的構(gòu)象而在不同的電泳位置被檢測(cè)到。當(dāng)某一種群的 DNA 在群落 DNA 中的含量少于 %時(shí)，SSCP 法便無(wú)法檢測(cè)到，若要研究群落中比例極少的群落，需用改進(jìn)的技術(shù)和類群特異的 PCR 引物來(lái)完成[50 ]。 變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE)和溫度梯度凝膠電泳(temperature gradient gel electrophoresis，TGGE) DGGE和TGGE被廣泛應(yīng)用于土壤微生物的多樣性研究、環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)的監(jiān)測(cè)等方面。DGGE或TGGE就是利用堿基序列上存在差異的不同來(lái)區(qū)分不同的基因序列。在堿基序列上存在差異的不同DNA雙鏈解鏈時(shí)需要不同的變性劑(尿素和甲酰胺的混合物)濃度，DNA 雙鏈一旦解鏈，其在聚丙烯酰胺凝膠中的電泳速度將會(huì)急劇下降。因此，將PCR擴(kuò)增得到的等長(zhǎng)DNA 片段加入到含有變性劑梯度的凝膠中進(jìn)行電泳，序列不同的DNA片段就會(huì)在各自相應(yīng)的變性劑濃度下變性，發(fā)生空間構(gòu)型的變化，導(dǎo)致電泳速度急劇下降， 從而使具有不同序列的DNA片段滯留于凝膠的不同位置，使用溴化乙錠、SYBR G