【文章內(nèi)容簡介】 異情況，通過生物信息學(xué)分析尋找潛在的毒力相關(guān)變異，為疫苗和診斷試劑研究等提供依據(jù)。（2）EV71變異與病毒毒力關(guān)系研究對不同地區(qū)EV71分離株體外細胞感染和體內(nèi)動物感染的不同特性進行分析比較，通過構(gòu)建一系列的突變重組病毒，鑒定影響EV71神經(jīng)毒力的關(guān)鍵位點。在上述研究的基礎(chǔ)上，選擇12個具有代表性的突變體進行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，了解突變對病毒顆粒表面結(jié)構(gòu)的影響，探討病毒變異導(dǎo)致抗原性改變的機制；挑選23個代表性的重要功能蛋白，如3C，3D蛋白突變體進行結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究，為揭示病毒變異導(dǎo)致功能和毒力變異機制提供基礎(chǔ)；利用EV71 亞基因組復(fù)制子探索在神經(jīng)細胞中復(fù)制的機理，揭示病毒基因組非編碼區(qū)及RNA依賴的RNA 聚合酶、宿主蛋白的相互作用對RNA復(fù)制的影響，鑒別出與病毒復(fù)制密切相關(guān)的宿主因子。 課題目標：（1）闡明19982009年我國大陸流行的EV71病毒的型別特點和進化特征； （2）闡明若干與病毒毒力有關(guān)的變異位點，獲得無神經(jīng)毒力重組病毒；（3）解析若干EV71變異體病毒顆粒和3C、3D等重要功能蛋白及其突變體的結(jié)構(gòu)；（4）鑒別出一組與病毒復(fù)制和翻譯有關(guān)的宿主因子，并部分闡明其作用機制；（5）建立我國EV71毒株庫，建立感染性克隆、亞基因組復(fù)制子等關(guān)鍵性研究技術(shù)平臺；（6）培養(yǎng)中青年科研骨干510人，博士后、研究生1520人；（7）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文25篇以上。承擔(dān)單位：中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所病毒基因工程國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室解放軍第302醫(yī)院中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室課題負責(zé)人：許文波，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：彭小忠，研究員，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)國家重點實驗室貌盼勇，研究員，解放軍第302醫(yī)院崔 勝，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室周世力，教 授，江漢大學(xué)經(jīng)費比例：%。課題3：EV71等病毒致病與免疫機制研究主要研究內(nèi)容：（1）EV71等病毒致病機制研究建立成年小鼠、恒河猴、轉(zhuǎn)基因小鼠等EV71感染動物模型；建立EV71病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，利用基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)檢測比較單純經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)同正常小鼠的腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞和周細胞表達譜差異，比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白；建立血腦屏障結(jié)構(gòu)細胞（腦微血管內(nèi)皮細胞、星形膠質(zhì)細胞、周細胞）和神經(jīng)軸突細胞、脊髓細胞、骨骼肌細胞的cDNA文庫及差異文庫，利用篩選與EV71蛋白質(zhì)相互作用的細胞因子或靶分子；利用轉(zhuǎn)基因或基因敲除技術(shù)對新發(fā)現(xiàn)的EV71入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)作用因子進行動物水平的系統(tǒng)研究，有針對性的比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異；闡明Toll樣受體對EV71病毒的識別機制及病毒編碼產(chǎn)物對干擾素激活抑制機制，探討天然免疫抑制與病毒致病機制的關(guān)系。（2）手足口病免疫保護機制的研究在縱向（不同病程）和橫向（不同病情程度、不同毒株感染）水平揭示病毒感染機體后免疫應(yīng)答的動態(tài)，闡明重要免疫細胞與病情發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的功能關(guān)聯(lián)性；探討不同劑量EV71感染中Th細胞亞型分化情況及其與疾病進展的關(guān)系；利用超速離心、電鏡、生物芯片以及實時細胞分析等技術(shù)探索EV71等病毒感染機體后免疫細胞間快速的信息交流和免疫抗原的傳遞等機制；利用動物模型揭示EV71滅活疫苗的免疫保護機制，力爭開展I、II期臨床試驗。課題目標：（1）揭示EV71侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分子機制；（2）揭示EV71拮抗干擾素激活機制及其與EV71致病性的關(guān)系；（3）揭示交叉反應(yīng)的CD4 T細胞對EV71免疫應(yīng)答和感染小鼠疾病進程的影響，EV71感染導(dǎo)致特異的Th細胞亞型分化情況及其與疾病進展的關(guān)系；（4）闡明EV71滅活疫苗的免疫保護機制和有效性評價指標；（5）和建立完善用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等保障條件；（6）培養(yǎng)中青年科研骨干1015人，博士后、研究生2025人；（7）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文30篇以上。承擔(dān)單位：中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所武漢大學(xué)病毒學(xué)國家重點實驗室中國科學(xué)院上海巴斯德研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物研究所衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點實驗室課題負責(zé)人：王健偉，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：李琦涵，研究員，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所秦 川，研究員，衛(wèi)生部比較醫(yī)學(xué)重點實驗室冷啟彬，研究員，中國科學(xué)院上海巴斯德研究所劉海鷹，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室劉映樂，副教授，病毒學(xué)國家重點實驗室雷曉波，助理研究員，病毒基因工程國家重點實驗室經(jīng)費比例：%。課題4：腦膜炎奈瑟菌變異規(guī)律和致病機制研究主要研究內(nèi)容：（1）腦膜炎奈瑟菌變異與流行規(guī)律研究研究我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律，研究不同血清群菌株之間莢膜合成基因簇的表達、基因缺失、基因水平轉(zhuǎn)移以及基因重組的調(diào)控機制。研究我國主要流腦流行菌株的粘附定植能力和相關(guān)毒力基因、蛋白的表達調(diào)控機制，以期了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；研究我國流腦菌侵襲力及相關(guān)基因蛋白特征，以期了解細菌的粘附和侵襲毒力基因與白的相互關(guān)系；研究我國流腦菌株的變異規(guī)律。（3）腦膜炎奈瑟菌變異與致病機制關(guān)系研究選擇不同血清群、不同年代、不同基因型別的流腦菌代表菌株，進行體外粘附試驗，比較不同流腦菌的粘附定植能力；分析我國流腦菌代表菌株流行變異規(guī)律和細菌在健康人群中定植傳播能力的關(guān)聯(lián)性；選擇與流腦菌粘附相關(guān)的因子編碼基因作為目的靶基因，進行序列測定分析，同時采用逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和RNA測序等技術(shù)手段進行粘附因子相關(guān)的關(guān)鍵基因轉(zhuǎn)錄水平檢測，研究粘附因子在不同流腦菌中的基因序列、轉(zhuǎn)錄水平、調(diào)控水平上的差異；進行細菌細胞相互作用實驗，研究不同流腦菌在侵襲力的差異性；通過序列測定檢測莢膜相關(guān)基因序列上的差異，利用逆轉(zhuǎn)錄PCR、熒光定量PCR和RNA測序等技術(shù)手段檢測莢膜相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，并進一步探索莢膜基因序列和轉(zhuǎn)錄水平的差異與其侵襲能力的可能關(guān)系；以小RNA為切入點，選擇部分腦膜炎奈瑟菌毒力相關(guān)基因（包括粘附定植、侵襲和抗吞噬等相關(guān)基因），采用生物信息學(xué)預(yù)測、RNA測序、DNA微陣列、逆轉(zhuǎn)錄PCR、Northern雜交等技術(shù)開展調(diào)控機制探索性研究。收集和選擇一定數(shù)量的中國流腦菌臨床菌株，利用新一代測序技術(shù)進行高通量序列分析，利用生物信息學(xué)技術(shù)手段尋找變異，并分析其規(guī)律。課題目標：（1）掌握我國主要流腦流行菌株血清群變異的規(guī)律；（2）了解我國流腦菌株在健康人鼻咽部的粘附和定植對菌株的擴散以及流腦流行的公共衛(wèi)生學(xué)意義；（3）了解細菌的粘附和侵襲毒力基因與蛋白的相互關(guān)系；（4）培養(yǎng)中青年研究骨干810人，博士后、研究生1520名；（5）在SCI收錄雜志上發(fā)表論文20篇以上。承擔(dān)單位：中國疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所病毒基因工程國家重點實驗室課題負責(zé)人：金奇，研究員，病毒基因工程國家重點實驗室主要學(xué)術(shù)骨干：邵祝軍，研究員， 傳染病預(yù)防控制國家重點實驗室王千秋，研究員，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所張笑冰，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室彭俊平，副研究員，病毒基因工程國家重點實驗室經(jīng)費比例：%。四、年度計劃研究內(nèi)容預(yù)期目標第一年誘導(dǎo)、分離和鑒定志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體；對志賀菌小RNA進行預(yù)測和統(tǒng)計，并對預(yù)測的小RNA進行初步驗證；分析福氏志賀氏菌1b和2b的全基因組序列，尋找并驗證負責(zé)O抗原側(cè)鏈修飾的噬菌體和關(guān)鍵基因。 驅(qū)除不同亞群和不同血清型志賀氏菌菌株中的毒力大質(zhì)粒，獲得含有志賀氏菌毒力大質(zhì)粒的大腸桿菌，進行志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達譜差異分析；比較不同EV71毒株的細胞和動物感染特性，構(gòu)建中國EV71主要流行株的感染性克隆，找出具有代表性突變序列，對EV71感染主要器官特別是神經(jīng)系統(tǒng)來源的細胞系進行EV71細胞受體的表達譜分析，構(gòu)建EV71亞基因組復(fù)制子；構(gòu)建成年小鼠和恒河猴等EV71感染動物模型，建立EV71病毒經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的感染模型和體外血腦屏障模型，描述經(jīng)由血腦屏障入侵中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達譜變化，比較不同的基因型和流行株的感染及神經(jīng)毒力差異，篩選能阻斷病毒復(fù)制的關(guān)鍵節(jié)點蛋白；對我國不同年代、不同血清群流腦菌株進行PFGE、MLST分子分型和種群結(jié)構(gòu)分析，篩選有代表性的菌株，建立細菌宿主細胞粘附相互作用技術(shù)方法以及莢膜相關(guān)基因序列差異性檢測技術(shù)；進行小RNA篩選；獲得研究所需菌毒種及樣本資源，進行分析并建立信息數(shù)據(jù)庫。誘導(dǎo)、分離到至少3種血清型轉(zhuǎn)換噬菌體，建立福氏志賀菌血清型轉(zhuǎn)換噬菌體庫；初步獲得志賀菌的小RNA庫，完成福氏志賀氏菌1b和2b的全基因組序列，證明O抗原側(cè)鏈修飾基因功能；初步完成志賀氏菌毒力大質(zhì)粒驅(qū)除前后的蛋白表達譜差異分析；完成對不同地區(qū)EV71分離株的序列分析測定，闡明其在細胞和動物上的感染特性，確立代表性突變序列, 構(gòu)建我國EV71主要流行株（亞型）感染性克隆，獲得EV71細胞受體在多組織來源的細胞系中的表達譜。初步建立用于EV71感染研究的體外血腦屏障模型、新型小鼠感染模型和恒河猴模型等，初步揭示不同類型病人細胞因子等表達譜、免疫調(diào)制特征和機制；完成500株流腦菌株DNA的提取和PFGE、MLST分型分析, 建立23種細菌宿主細胞粘附相互作用細胞模型, 建立莢膜基因簇相關(guān)基因檢測和差異性分析技術(shù), 完成代表株RNA測序；初步完成有關(guān)菌毒株的收集工作；發(fā)表SCI論文810篇。第二年對獲得的血清型相關(guān)噬菌體進行基因組序列測定和鑒定，比較其與非優(yōu)勢血清型相關(guān)噬菌體的特征差異，尋找噬菌體基因組上優(yōu)勢決定