營養(yǎng)組學研究進展(編輯修改稿)
2025-07-25 06:48 本頁面
【文章內容簡介】 法做扼要的介紹。① 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳。2DPAGE是比較蛋白質組中蛋白表達量變化最常用的蛋白分離技術。傳統(tǒng)的2DPAGE最初是由O,Farrell、Klose及Scheele等于1975年分別建立起來的。此法可分離上千種蛋白，并可同時比較蛋白表達量的差異，可根據(jù)蛋白等電點及分子質量的差別，有效地分離理化性質不同的蛋白，并可同時進行定性和定量分析，可區(qū)分磷酸化及非磷酸化蛋白或某些經(jīng)過翻譯后加工修飾的蛋白。主要分為2步，第1步等點聚焦采用pH梯度膠根據(jù)蛋白等電點的不同進行電泳分離；第2步是根據(jù)蛋白分子質量的差異進行蛋白分離。不足之處在于(仍主要依賴許多手工操作、費時、自動化程度不高，樣品上樣量有限，不易分析蛋白含量很低的臨床樣本amp。對某些高疏水性蛋白，如細胞膜蛋白，分離效果差，對表達量較低的蛋白（1000拷貝數(shù)）、極酸性（pI3）或極堿性（pI10）的蛋白檢測均不理想；某些蛋白斑點中可能含有等電點和分子質量極為接近的數(shù)種蛋白，會給數(shù)據(jù)分析帶來困難，還有一些蛋白由于分子質量太大（150 ku）或太?。?0 ku）容易在分離過程中被丟失，會增大蛋白質組重復性分析的誤差。通過首先分離純化亞細胞器，然后富集其中的蛋白或蛋白復合物可降低蛋白質組的復雜程度$提高蛋白檢測的靈敏度，并有助于了解蛋白在細胞內的定位分布。采用免疫學方法去除樣本中的高豐度蛋白，也會有利于低豐度蛋白的檢出。研究進展：為進一步提高2DPAGE的靈敏度、分辨率及重復性，Unlu等人建立了雙向熒光差異凝膠電泳法（twodimensional different ingel electrophoresis,2DDIGE）。這種方法用不同的熒光染料標記，要比較的蛋白質組樣品%在同一塊電泳膠上分離，定量比較表達量有差異的蛋白%具有重復性好，靈敏度高及能與質譜聯(lián)用鑒定蛋白質等優(yōu)點。但其缺點是難以對多個蛋白質組同時進行比較，而且由于試驗儀器，分析軟件，檢測試劑等相對昂貴，不利于普及。② 質譜 。質譜是鑒定蛋白的最常用技術。世紀初期英國物理學家Thomson等的工作奠定了質譜分析的基礎，并因此獲得了1906年的諾貝爾物理學獎。最初的質譜僅能分析揮發(fā)性小分子物質，隨著離子化技術的出現(xiàn)，使質譜測定極性強$難揮發(fā)的生物蛋白大分子得以實現(xiàn)，質譜分析目前已成為鑒定蛋白最常用的核心技術，具有快速、靈敏、重復性好、自動化程度高等特點。值得指出的是質譜技術不是直接分析完整的，未經(jīng)裂解的蛋白分子，而主要是分析經(jīng)特異的蛋白酶，如胰酶水解后得到的肽段混合物。質譜分析的主要步驟包括樣品氣化、分離、檢測及數(shù)據(jù)處理等。其原理是將所要分析的樣品在離子化裝置內從分子形式轉化為氣態(tài)離 子，然后根據(jù)不同離子間的質荷比，差異來確定離子化分子的相對質量，從而獲得1個蛋白或多肽的分子質量，不同的蛋白分子有其固有的分子質量，每個蛋白分子的氨基酸組成、序列及翻譯后修飾方式的不同都可通過蛋白的分子質量反映出來，因此對組成蛋白的多肽或氨基酸的分子質量測定就是對蛋白的結構、性
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