營(yíng)養(yǎng)組學(xué)研究進(jìn)展(編輯修改稿)
2025-07-25 06:48 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 法做扼要的介紹。① 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳。2DPAGE是比較蛋白質(zhì)組中蛋白表達(dá)量變化最常用的蛋白分離技術(shù)。傳統(tǒng)的2DPAGE最初是由O,Farrell、Klose及Scheele等于1975年分別建立起來(lái)的。此法可分離上千種蛋白，并可同時(shí)比較蛋白表達(dá)量的差異，可根據(jù)蛋白等電點(diǎn)及分子質(zhì)量的差別，有效地分離理化性質(zhì)不同的蛋白，并可同時(shí)進(jìn)行定性和定量分析，可區(qū)分磷酸化及非磷酸化蛋白或某些經(jīng)過(guò)翻譯后加工修飾的蛋白。主要分為2步，第1步等點(diǎn)聚焦采用pH梯度膠根據(jù)蛋白等電點(diǎn)的不同進(jìn)行電泳分離；第2步是根據(jù)蛋白分子質(zhì)量的差異進(jìn)行蛋白分離。不足之處在于(仍主要依賴許多手工操作、費(fèi)時(shí)、自動(dòng)化程度不高，樣品上樣量有限，不易分析蛋白含量很低的臨床樣本amp。對(duì)某些高疏水性蛋白，如細(xì)胞膜蛋白，分離效果差，對(duì)表達(dá)量較低的蛋白（1000拷貝數(shù)）、極酸性（pI3）或極堿性（pI10）的蛋白檢測(cè)均不理想；某些蛋白斑點(diǎn)中可能含有等電點(diǎn)和分子質(zhì)量極為接近的數(shù)種蛋白，會(huì)給數(shù)據(jù)分析帶來(lái)困難，還有一些蛋白由于分子質(zhì)量太大（150 ku）或太?。?0 ku）容易在分離過(guò)程中被丟失，會(huì)增大蛋白質(zhì)組重復(fù)性分析的誤差。通過(guò)首先分離純化亞細(xì)胞器，然后富集其中的蛋白或蛋白復(fù)合物可降低蛋白質(zhì)組的復(fù)雜程度$提高蛋白檢測(cè)的靈敏度，并有助于了解蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位分布。采用免疫學(xué)方法去除樣本中的高豐度蛋白，也會(huì)有利于低豐度蛋白的檢出。研究進(jìn)展：為進(jìn)一步提高2DPAGE的靈敏度、分辨率及重復(fù)性，Unlu等人建立了雙向熒光差異凝膠電泳法（twodimensional different ingel electrophoresis,2DDIGE）。這種方法用不同的熒光染料標(biāo)記，要比較的蛋白質(zhì)組樣品%在同一塊電泳膠上分離，定量比較表達(dá)量有差異的蛋白%具有重復(fù)性好，靈敏度高及能與質(zhì)譜聯(lián)用鑒定蛋白質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)。但其缺點(diǎn)是難以對(duì)多個(gè)蛋白質(zhì)組同時(shí)進(jìn)行比較，而且由于試驗(yàn)儀器，分析軟件，檢測(cè)試劑等相對(duì)昂貴，不利于普及。② 質(zhì)譜 。質(zhì)譜是鑒定蛋白的最常用技術(shù)。世紀(jì)初期英國(guó)物理學(xué)家Thomson等的工作奠定了質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)，并因此獲得了1906年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。最初的質(zhì)譜僅能分析揮發(fā)性小分子物質(zhì)，隨著離子化技術(shù)的出現(xiàn)，使質(zhì)譜測(cè)定極性強(qiáng)$難揮發(fā)的生物蛋白大分子得以實(shí)現(xiàn)，質(zhì)譜分析目前已成為鑒定蛋白最常用的核心技術(shù)，具有快速、靈敏、重復(fù)性好、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)。值得指出的是質(zhì)譜技術(shù)不是直接分析完整的，未經(jīng)裂解的蛋白分子，而主要是分析經(jīng)特異的蛋白酶，如胰酶水解后得到的肽段混合物。質(zhì)譜分析的主要步驟包括樣品氣化、分離、檢測(cè)及數(shù)據(jù)處理等。其原理是將所要分析的樣品在離子化裝置內(nèi)從分子形式轉(zhuǎn)化為氣態(tài)離 子，然后根據(jù)不同離子間的質(zhì)荷比，差異來(lái)確定離子化分子的相對(duì)質(zhì)量，從而獲得1個(gè)蛋白或多肽的分子質(zhì)量，不同的蛋白分子有其固有的分子質(zhì)量，每個(gè)蛋白分子的氨基酸組成、序列及翻譯后修飾方式的不同都可通過(guò)蛋白的分子質(zhì)量反映出來(lái)，因此對(duì)組成蛋白的多肽或氨基酸的分子質(zhì)量測(cè)定就是對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)、性
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