【文章內(nèi)容簡介】 ）與 VR醛固酮（ALD）與 VR：醛固酮的生理作用：1 引起水鈉潴留、低鉀低鎂血癥發(fā)生。2．抑制迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)通道，增強交感神經(jīng)活性抑制迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)通道，使壓力反射性心動過緩反應減弱。3．ALD 受體復合物進入細胞核與 DNA 結(jié)合，影響 I、 Ⅲ型膠原基因表達，使得膠原合成增多同時膠原降解速度減慢，對于心肌肌小節(jié)數(shù)量、排列及心肌細胞直徑大小、細胞間質(zhì)等產(chǎn)生影響,促進 VR[11]。CHF 治療中的“ALD 逃逸現(xiàn)象”：在心衰時，由于血管緊張素水平增高，刺激ALD 合成分泌增多。短期使用 ACEI 治療 CHF 時 ALD 下降，但長期應用 ACEI 時，常出現(xiàn)“ALD 逃逸現(xiàn)象” ，即 ALD 水平不能保持穩(wěn)定安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文15持續(xù)的降低 [12,13]。研究發(fā)現(xiàn)，盡管聯(lián)合應用了 ACEI 和血管緊張素受體拮抗劑(ARB)不能完全長期抑制 ALD 的產(chǎn)生。低鈉和高鉀是刺激ALD 分泌的主要原因；由于 ALD 在 CHF 的病理生理中的作用及“ALD 逃逸現(xiàn)象” ，決定了 CHF 現(xiàn)代治療方案中 ALD 受體拮抗劑具有不可替代的作用。 交感迷走神經(jīng)失衡與 VR心臟自主神經(jīng)之間的不平衡，在心力衰竭的發(fā)展中有著重要作用。交感神經(jīng)的過度活化促進心肌細胞凋亡，加速 VR，促進心力衰竭的發(fā)生 。目前，抑制交感神經(jīng)活性的藥物，如 β 受體阻滯劑，明顯抑制了心肌重構(gòu)的發(fā)生，延緩了心力衰竭的進程，提高了心力衰竭患者的存活時間，因此干預自主神經(jīng)是治療心力衰竭有效的手段。有關(guān)動物研究顯示：刺激迷走神經(jīng)有利于抑制 VR，改善心功能，提高生存率 [14]。一項多中心開放性研究納入 32 例心功能 IIIV 級心力衰竭病人，植入迷走神經(jīng)刺激裝置，規(guī)律刺激患者迷走神經(jīng)達患者最大耐受程度，隨訪一年，發(fā)現(xiàn)患者 6min 步行由刺激前的（ 411177。76）米上升到（471177。111）米。射血分數(shù)（LVFE）由刺激前的（22177。7）%提高到（29177。8）% ，該實驗證實植入迷走神經(jīng)刺激裝置的安全性，初步結(jié)果證實迷走神經(jīng)刺激對心力衰竭的治療作用 [15]。然而，目前關(guān)于直接迷走神經(jīng)治療心力衰竭的臨床試驗比較有限，其有效性、可行性及安全性仍需要進一步探討。安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文16．1 心肌細胞凋亡與 VR心肌細胞凋亡是一個無炎癥反應的過程，在心臟的生理和病理發(fā)展過程中均起著重要作用，是心臟由代償性變化向病理性變化發(fā)展的細胞學基礎(chǔ)。典型特征為細胞縮小，染色質(zhì)凝集，核膜折疊，核仁裂解，繼而細胞膜出泡（胞？），分割細胞為多個凋亡小體，凋亡小體進而被具有吞噬功能的細胞如巨噬細胞吞噬、降解。心肌缺血、缺氧、缺血再灌注、低氧、壓力及容量負荷過重、自由基產(chǎn)生過多、細胞內(nèi)游離鈣濃度過高以及高濃度血管緊張素等因素均可通過多種途徑誘導心肌細胞發(fā)生凋亡，如 Bax 炎癥因子途徑、線粒體途徑和肌漿網(wǎng)途徑等 [16,17]。在急性 MI 后的心室重塑過程中，心肌細胞凋亡也是導致心肌細胞數(shù)量減少的重要原因，梗死區(qū)、非梗死區(qū)及梗死后終末期心力衰竭患者的心肌組織中均有心肌細胞凋亡現(xiàn)象的存在。在結(jié)扎大鼠冠狀動脈后 2 h，梗死區(qū)即出現(xiàn)細胞凋亡并迅速達到高峰；結(jié)扎后 6 h，細胞凋亡為細胞死亡的主要形式 [18]。在正常發(fā)育過程中，心肌細胞凋亡的數(shù)目具有增齡性變化特征 [19]，是維持心臟組織形態(tài)和功能相對穩(wěn)定的細胞學基礎(chǔ)，并且在心臟形態(tài)轉(zhuǎn)型和重塑中發(fā)揮平衡作用 ，表明無論在正常生理或病理條件下，心肌細胞均存在著凋亡現(xiàn)象，具有增齡性變化特征，凋亡可導致心肌細胞大量減少，并對心功能產(chǎn)生嚴重影響。 心肌細胞再生與 VR安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文17目前已有大量臨床及動物實驗證實干細胞移植促心肌細胞再生、改善 VR 的有效性及安全性。David 等人的 TOPCAREAMI 試驗，通過冠狀動脈內(nèi)輸注祖細胞促心肌細胞再生，隨訪 5 年發(fā)現(xiàn)患者 NTproBNP 的水平仍然顯著減少，雖然 LV 收縮末期容積保持穩(wěn)定， LV舒張末期容積顯著增加，射血分數(shù)明顯提高，心功能顯著改善，并且并未發(fā)現(xiàn)腫瘤及心內(nèi)鈣化等 [20]。但統(tǒng)觀點認為，成體心肌細胞不再進行分裂增殖，細胞數(shù)目也不再增加，需進行干細胞移植來促進心肌細胞再生，近期 Bergmann 等人提供了心肌細胞再生的證據(jù)。他們利用大氣中的放射性污染發(fā)現(xiàn)，在人的生長過程中，心肌細胞確實能夠在一定程度上進行更新。冷戰(zhàn)時期核彈實驗引起大氣中的 14C（ 14C）水平增加，這時期地球上所有生物的細胞中的 14C（ 14C）水平都增加。當核實驗被禁止之后，人類 DNA 中 14C（ 14C）水平開始慢慢地下降。細胞在進行最后一次分裂之后，其 DNA 成分不再變化。因此，基因組 DNA 中 14C（ 14C）的水平可以作為細胞出生的日期標記。他們監(jiān)測在核彈爆炸前出生的 5 名受試者心肌細胞 DNA 中 14C（ 14C）的含量，結(jié)果顯示 14C（ 14C）要高于爆炸前大氣中的含量，這表明在核彈爆炸后仍有 DNA 的合成；監(jiān)測核彈爆炸后出生的 7 名受試者心肌細胞 DNA 中 14C（ 14C）的含量與他們出生幾年后的大氣中含量一致，提示出生后存在 DNA 的合成。利用數(shù)學模型根據(jù)受試者心肌細胞中14C（ 14C） 的水平分析其更新率，發(fā)現(xiàn)每年可更新 0．2％到 2％ ，并且與年齡呈負相關(guān)(R=一（）0．84，P=0．001) ，25 歲時每年可更安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文18新約 1％ ，而 75 歲時每年僅更新 0．45％ 。人一生中約為 50％ 的心肌細胞是新產(chǎn)生的，但是這些新產(chǎn)生的心肌細胞并不能確認是來自心肌細胞的復制還是干／祖細胞庫的分化。研究結(jié)果提示我們利用藥物刺激內(nèi)源性心肌更新以治療心臟病可能具有很好的臨床前景 [21]。較心肌細胞移植，促心肌細胞再生的優(yōu)點在于無創(chuàng)性以及可以避免免疫抑制的應用。但目前我們關(guān)于心肌細胞再生的機制及影響因素的了解有限，相關(guān)研究仍需繼續(xù)。 細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase ,MMP）及其抑制劑（matrix metalloproteinase inhibitor,TIMP）與 VRMI 后除心肌細胞本身的結(jié)構(gòu)、代謝及功能異常外，心肌細胞外基質(zhì)(Extracellular matrix，ECM)尤其是心肌膠原亦發(fā)生異常改變，ECM 成分的過分降解可能導致病理性 VR。 ECM 提供了細胞遷移、生長和分化的環(huán)境，主要功能有：① 為心肌細胞、血管和淋巴管的相互聯(lián)系和排列提供支持，從而決定心肌的僵硬度和結(jié)構(gòu)，防止心肌細胞過度伸長及過度回縮，防止心肌細胞和肌纖維滑脫。②將心肌細胞產(chǎn)生的壓力傳至心室腔，提供心肌舒張時的阻力，給心肌提供張力強度以防止其斷裂；近年來 MI 后細胞外基質(zhì)金屬蛋白酶（ MMP）及其抑制劑（TIMP）之間的平衡與 VR 之間的關(guān)系是研究比較多，比較有爭議的話題。 MMP 與 VR安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文19MMPs 是一類包含鋅離子的內(nèi)源性蛋白水解酶，有著相似的亞基結(jié)構(gòu)。目前已發(fā)現(xiàn)的 MMPs 家族成員有 20 多種，根據(jù)其底物的特異性和結(jié)構(gòu)的差異分為四大類。第一類為膠原酶(MMP 一（）1，8，l3 等)，其主要水解底物是纖維類膠原，即 3 型膠原；第二類為明膠酶(MMP2，9)，主要水解變性膠原及基膜的主要成分 4 型膠原；第三類為基質(zhì)水解酶類(MMP3，10，11 等)，其中 MMP3 和 MMP 一（）10的水解底物比較廣泛，如Ⅳ型膠原、蛋白聚糖、明膠及糖蛋白等；第四類為結(jié)構(gòu)與功能比較特殊的 MMPs(MMP 一（）7，12，19，20，23，26 等)，其除能降解幾種 ECM 成分外，還能激活其他 MMPs。Bergmann 等人發(fā)現(xiàn)心臟基質(zhì)金屬蛋白酶 2（MMP2）的表達異常與 VR 和心臟收縮功能障礙密切相關(guān) [22]，許多動物實驗證實，MMP 降解細胞外的基質(zhì)在 AMI 后心臟破裂過程中起著重要的作用，Susanne 等人監(jiān)測因 AMI 心臟破裂死亡患者梗死區(qū) MMP8 和 MMP9 的含量明顯身高，進而引起的炎性細胞的浸潤更加突出，最終促進梗死后心臟破裂 [23]，進一步闡述了 MMP 與 VR 及 MI 后心室功能密切相關(guān)。 TIMP 與 VR基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)TIMPs 是近年來發(fā)現(xiàn)的 MMPs的天然抑制物，是一組能抑制 MMPs 活性的多功能因子家族，是體內(nèi)細胞分泌的一類蛋白酶抑制劑，在腫瘤組織與間質(zhì)細胞中均可表達 。TIMPs 家族是一個多基因家族的編碼蛋白，目前已證實的 TIMPs 有安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文204 種(TIMP1，TIMP2，TIMP3 和 TIMP4)，它們的表達在發(fā)育和組織重構(gòu)中受調(diào)控，它通過對 MMPs 的抑制在正常細胞外基質(zhì)改建和各種病理過程中發(fā)揮重要作用 [24]。在病理條件下，TIMPs 水平的變化與MMPs 變化不平衡可直接影響 MMPs 活性。TIMPs 主要從兩個方面抑制MMPs 的激活：① 在酶原活化階段：TIMP 與 pro MMP 可形成穩(wěn)定的復合體，并阻礙 pro MMP 的酶原自我激活；② 在活化的 MMP 階段：TIMP 可直接與活化的 MMP 形成緊密的 1：1 復合體，抑制其活性。目前關(guān)于 MI 后 46 小時及 24 周血漿 TIMP 濃度的研究提示：心功能不全患者 24 周后血漿 TIMP1 水平較 46 小時明顯降低，而 TIMP2 及TIMP4 水平明顯增高，尤其是 TIMP4。TIMP2 及 TIMP4 均與左室收縮末及舒張末容正相關(guān)。該實現(xiàn)提出早期檢測血漿 TIMP4 對于預測心功能的重要性，其濃度變化與 VR 密切相關(guān) [25]。MMPs 選擇性地消化分解細胞外基質(zhì)中的各成分，與 TIMPs 抑制作用二者相互作用形成相對平衡的狀態(tài)，控制調(diào)節(jié)細胞外基質(zhì)組織膠原的生成代謝和更新。Wei Y 等人的研究顯示，終末期心衰病人往往伴隨有 MMP10 和 MMP7 的水平大量增加，同時伴隨著 TIMP4 的降低，該研究提示 MMP/TIMP 比例的失衡在 VR 過程中起著重要的作用，并且MMP10 可能成為在 VR 研究領(lǐng)域除 MMPMMP9 以外的一個新的熱點研究因子 [26]。Polyakova 等人關(guān)于不同類型終末期心衰的研究顯示：安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文21正常情況下 TIMP/MMP 大概為 ，而缺血型心肌病其比值增加到，但在擴張型心肌病及其它類型心肌病其比值往往低于 。同時他們監(jiān)測到膠原 I/膠原 III 比值的增加與心室舒張末期壓力成負相關(guān)。不同類型的心肌病終末期心衰的病人 MMP 與 TIMP 之間關(guān)系的失衡影響到心肌纖維代謝及各種細胞因子的表達，最終導致心肌纖維化和 VR,進一步發(fā)展為嚴重的心功能不全 [27]。 多西環(huán)素與 VR多西環(huán)素系土霉素結(jié)構(gòu)改造所得的一種長效四環(huán)素類抗生素，用于大多數(shù)革蘭陽性和陰性菌。近年來發(fā)現(xiàn)，該藥還是一類廣譜的 MMP活性抑制劑，目前已在臨床上用于牙周病、骨關(guān)節(jié)炎、腹主動脈瘤和腫瘤轉(zhuǎn)移等間質(zhì)疾病的治療 [28,29,30]。多西環(huán)素抑制 MMP 的機制尚不完全清楚，可能的機制有：(1)多西環(huán)素能直接與 MMP 的 zn2+和 Ca2+結(jié)合，從而抑制酶的活性區(qū)，并可誘導酶原的構(gòu)型改變，使之易于分解 ；(2)多西環(huán)素能抑制 MMP 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄，并能使酶原在細胞外激活過程中降解 [31,32]；(3)多西環(huán)素還有可能通過抑制 TIMP 的表達，降低MMP 的釋放和激活 [33]；(4)多西環(huán)素可以通過對 TGFβ 和 IL 的作用(通常 TGFβ 可抑制 MMP 表達；而 IL 則相反)，間接抑制 MMP 的表達[34,35]。多西環(huán)素能通過抑制 MMP 的釋放和激活，有效減輕左室重構(gòu)，緩解左室收縮和舒張功能，延緩心力衰竭的進展；還可穩(wěn)定動脈粥樣斑塊，預防和減少急性冠脈綜合征的發(fā)生，降低心臟急性事件的發(fā)生安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文22率。在經(jīng)過大規(guī)模臨床隨機對照試驗獲得大量循證醫(yī)學證據(jù)后，有望用于臨床心血管疾病的防治。本實驗通過建立大鼠心肌梗死模型。觀察多西環(huán)素作為外源性 MMPs 抑制劑對心肌梗死后心功能的保護作用。 實驗材料 實驗動物雄性 SD（Spraguedawley）大鼠 48 只，體重 250～270 g，均由安徽醫(yī)科大學實驗動物中心提供。 主要儀器實驗用小型呼吸機(HXQ1 型)多道電生理儀(成都儀器廠，RM6240 型)IE33 超聲心動圖機(荷蘭，飛利浦公司)電熱恒溫水浴鍋 上海天平儀器廠隔水式電熱培養(yǎng)箱 江蘇東臺縣電器廠5415R 小型高速冷凍離心機 德國 Eppendorf 公司Minispin 小型離心機 德國 Eppendorf 公司超速離心機 德國 Beakman 公司托盤天平 上海第二天平儀器廠電子分析天平 上海奧豪斯公司安 徽 醫(yī) 科 大 學 碩 士 學 位 論 文23TSA 型脫色搖床 江蘇國勝實驗儀器廠ZD9556 水平脫色搖床 江蘇省太倉科教器材廠冰凍切片機 德國 Leica 公司超低溫冰箱 日本 Sanyo 公司共聚焦顯微鏡 Zeiss 公司倒置顯微鏡 Olympus 公司水平電泳儀 北京東方特力電泳電