【正文】 wall 左心室后壁安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文6LVSD Left ventricular end systolic diameter 左室收縮末期內(nèi)徑LVEDD Left ventricular enddiastolic dimension 左室舒張末內(nèi)徑LVFS Left ventricular fractional shortening 左室短軸縮短率LVEF Left ventricular ejection fraction 左心室射血分?jǐn)?shù)RAAS Reninangiotensinaldosterone system 腎素血管緊張素 醛固酮系統(tǒng) 安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文7中文摘要多西環(huán)素抑制基質(zhì)金屬蛋白酶對心肌梗死大鼠左室重構(gòu)和心功能的影響研究目的 觀察多西環(huán)素（Doxycycline）對心肌梗死（Myocardial infarction， MI）后大鼠心肌基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）和基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）活性的影響及其對大鼠心肌梗死后心衰（ Heart failure，HF）和左心室重構(gòu)(Left ventricular remodeling，LVR)的保護(hù)作用。研究結(jié)果 MI 2 周后與模型組相比，心臟彩超提示：多西環(huán)素組左室前壁（Left ventricular anterior wall，LVAW）厚度明顯增加（P） ，左室舒張末期內(nèi)徑(Left ventricular enddiastolic dimension，LVDD)縮?。≒） ，左室短軸縮短率( Left ventricular fractional shortening， LVFS)顯著增加，左心室射血分?jǐn)?shù)（Left ventricular ejection fraction，LVEF）增高。心肌梗死導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌損傷，心肌損傷后基因組表達(dá)改變引起的分子、細(xì)胞和間質(zhì)的改變，分子改變表現(xiàn)為炎癥因子、基質(zhì)金屬蛋白酶和生長因子等的表達(dá)增加，細(xì)胞的改變包括心肌細(xì)胞的肥大、壞死、凋亡和成纖維細(xì)胞的增殖等，間質(zhì)的改變表現(xiàn)為細(xì)胞外基質(zhì)的降解及安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文12膠原聚集又稱纖維化。AT1 受體存在于心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、血小板、神經(jīng)末梢和傳導(dǎo)系統(tǒng)，介導(dǎo)所有已知的 AngII 的心血管作用，特別是通過活化細(xì)胞周期蛋白、降低細(xì)胞周期激酶抑制因子而加強(qiáng)血管壁 DNA 的合成 。目前臨床應(yīng)用較多的是 ACEI、ARB，一項(xiàng)大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)顯示：纈沙坦和卡托普利在改善心功能，抑制梗死后 VR 作用類似，但是 ACEI 和 ARB 聯(lián)合組并不能減低死亡率，反而臨床上不良事件增加，故臨床上建議單一用藥 [10]。 交感迷走神經(jīng)失衡與 VR心臟自主神經(jīng)之間的不平衡，在心力衰竭的發(fā)展中有著重要作用。7）%提高到（29177。在正常發(fā)育過程中，心肌細(xì)胞凋亡的數(shù)目具有增齡性變化特征 [19]，是維持心臟組織形態(tài)和功能相對穩(wěn)定的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，并且在心臟形態(tài)轉(zhuǎn)型和重塑中發(fā)揮平衡作用 ，表明無論在正常生理或病理?xiàng)l件下，心肌細(xì)胞均存在著凋亡現(xiàn)象，具有增齡性變化特征，凋亡可導(dǎo)致心肌細(xì)胞大量減少，并對心功能產(chǎn)生嚴(yán)重影響。因此，基因組 DNA 中 14C（ 14C）的水平可以作為細(xì)胞出生的日期標(biāo)記。 ECM 提供了細(xì)胞遷移、生長和分化的環(huán)境，主要功能有：① 為心肌細(xì)胞、血管和淋巴管的相互聯(lián)系和排列提供支持，從而決定心肌的僵硬度和結(jié)構(gòu)，防止心肌細(xì)胞過度伸長及過度回縮，防止心肌細(xì)胞和肌纖維滑脫。在病理?xiàng)l件下，TIMPs 水平的變化與MMPs 變化不平衡可直接影響 MMPs 活性。同時(shí)他們監(jiān)測到膠原 I/膠原 III 比值的增加與心室舒張末期壓力成負(fù)相關(guān)。觀察多西環(huán)素作為外源性 MMPs 抑制劑對心肌梗死后心功能的保護(hù)作用。 SD 雄性大鼠心臟彩超檢查安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文28兩周后將三組MI大鼠用戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射(70 1)麻醉、稱重后，電生理儀監(jiān)測心電圖情況，氣管插管呼吸機(jī)支持的情況下，用HP5500型心臟彩超機(jī)進(jìn)行心臟超聲檢查。試劑(A)染色 5min～10min。試劑(E)洗 1min。上述蛋白提取物分裝后置于80℃冰箱保存?zhèn)溆?待測活性樣本的準(zhǔn)備BCA 法測定上清液中蛋白濃度。表明心肌梗死后大鼠左室腔明顯擴(kuò)大，左室前壁變薄，多數(shù)膨出成室壁瘤。 177。 177。 LVSd = Left ventricular end systolic diameter。安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文35Fig 5 HW/BW of each group A: Shamoperated group。安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文36Fig 6 Typical Masson staining of each group (10)A: Shamoperated group。 B: Model group。本研究用多西環(huán)素對MI大鼠進(jìn)行干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多西環(huán)素可明顯改善MI大鼠的心功能，改善梗死后左室重構(gòu)，本研究結(jié)果顯示，多西環(huán)素對MI后左室重構(gòu)的影響主要依賴于其對MMPs活性的抑制。一方面，MMPs可能通過直接的基質(zhì)組份降解、調(diào)節(jié)基質(zhì)素的形成和細(xì)胞安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文39外基質(zhì)(ECM)釋放生物活性因子而參與纖維化和重構(gòu)的過程，這些生物活性因子包括轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGFβ1 )、胰島素樣生長因子(IGF)以及成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)等。 有研究表明MMP抑制劑多西環(huán)素可降低體內(nèi)炎癥因子如C反應(yīng)蛋白、髓過氧化物的水平，進(jìn)一步的抑制左室重構(gòu)的進(jìn)展[45,46]。多西環(huán)素處理組與模型組上述指標(biāo)均有顯著改善?？傊?，心肌梗死發(fā)生之后心肌組織中MMPs的活化促進(jìn)了MI 后左安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文41室重構(gòu)和心衰的發(fā)展，而抑制MMPs的活性，有可能改善心肌梗死后左室重構(gòu)，提高患者的心功能。104(7):92535. [9]. Kaschina E, Grzesiak A, Li J,et al. Angiotensin II Type 2 Receptor Stimulation A Novel Option of Therapeutic Interference With the ReninAngiotensin System in Myocardial Infarction? 。（1）多西環(huán)素對MI后大鼠心肌組織中的MMPMMP9活性存在明顯抑制作用；（2）多西環(huán)素通過抑制MMPMMP9活性使得MI大鼠梗死面積百分比明顯縮?。唬?）多西環(huán)素通過抑制MMPMMP9活性使得MI大鼠左室重構(gòu)情況明顯改善，HW/BW顯著降低，LVFS及LVEF明顯增高；（4）多西環(huán)素通過抑制 MMPMMP9 活性，減少 MI 大鼠心肌纖維化；總之：多西環(huán)素能夠通過抑制心肌 MMPMMP9 的活性、縮小梗死面積、減輕存活心肌的纖維化而改善心肌梗死大鼠的心功能和左室重構(gòu)。多西環(huán)素治療能夠抑制左室重構(gòu)的過程，使左心室擴(kuò)張的程度明顯減小。本實(shí)驗(yàn)研究的重點(diǎn)是觀察用外源性TIMP多西環(huán)素治療對MI大鼠心功能的影響?；|(zhì)素是一些基質(zhì)肽片段，它們具有調(diào)節(jié)結(jié)締組織細(xì)胞活性的性能，由于MMPs在一些基質(zhì)素的形成中起了積極的作用[39,40]。MI后左心室結(jié)構(gòu)取決于細(xì)胞外基質(zhì)降解及膠原纖維積聚的平衡。MI后心力衰竭正逐漸成為MI 患者死亡的主要原因 [36]。 C: Doxycycline group 多西環(huán)素對心肌梗死大鼠心肌MMPMMP9活性的影響通過明膠酶法檢測各組大鼠 MMPMMP9 的活性，分別用多西環(huán)素組和模型組的 MMP2 和 MMP9 條帶與假手術(shù)組相應(yīng)條帶比較，分別得到兩組大鼠的 MMP2 和 MMP9 相對灰度值，其大小代表 MI 大鼠心肌MMP2 和 MMP9 的相對活性，結(jié)果如圖 5 所示：多西環(huán)素組大鼠心肌中 MMP9 的活性較模型組顯著降低（177。 C: Doxycycline group(* P Compared with Shamoperated group。 LVEF = Left ventricular ejection fraction。 *LVEF (%) 177。 177。多西環(huán)素處理組與模型組相比，左室前壁變薄、心腔擴(kuò)大以及左室收縮功能下降等均有顯著改善（P）。無離子水：用于稀釋濃縮型試劑溶液 毫升離心管：用于樣品處理的容器15 毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器50 毫升錐形離心管：用于膠體溶液配制的容器培養(yǎng)箱：用于孵育反應(yīng)物電泳儀：用于蛋白樣品電泳分離平式搖蕩儀：用于孵育和混勻反應(yīng)1． 移出 毫升 GENMED 膠體液（Reagent A）到 50 毫升錐形離心管里2． 加入 微升 GENMED 凝結(jié)液（Reagent B）3． 加入 微升 GENMED 促進(jìn)液（Reagent C）4． 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文315． 在室溫下孵育 45 分鐘，或直至膠體凝結(jié)6． 移出 毫升 GENMED 膠頂液（Reagent D）到 15 毫升錐形離心管里7． 加入 微升 GENMED 凝結(jié)液（Reagent B）8． 加入 微升 GENMED 促進(jìn)液（Reagent C）9． 混勻后，即刻移入玻璃槽，避免氣泡10．插入 毫米厚的 10 孔梳11．在室溫下孵育 45 分鐘，或直至膠體凝結(jié)12．將玻璃槽移入到電泳槽里13．加入適量的含有 GENMED 電泳液（Reagent E）的 GENMED 電泳工作液14．小心拔去 10 孔梳15．用吸管或 1 毫升槍頭沖洗樣品孔備用16．從－70℃冰箱里取出待測樣品（注意：樣品須澄清；參見注意事項(xiàng) 3）17．移取 10 微升樣品（20 微克總量）到 毫升離心管18．加入 微升 GENMED 上樣液（Reagent F），混勻19．室溫下靜置 10 分鐘20．小心移取 20 微升樣品到玻璃槽的樣品孔里（包括用戶自備的蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣）21．電泳運(yùn)行 1 至 2 小時(shí)，電壓為 125 伏，直至染料前沿到達(dá)膠底安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文32處22．關(guān)閉電源，取出玻璃板，小心拆開，避免損壞膠體23．放進(jìn)塑料盒24．加入 90 毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里25．加入 毫升 GENMED 復(fù)性液（Reagent G）26．室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育 1 小時(shí)，速度為 50RPM27．小心倒掉復(fù)性液28．加入 90 毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里29．加入 毫升 GENMED 消化液（Reagent H）30．放進(jìn) 37℃培養(yǎng)箱里，在平式搖蕩儀上孵育 20 小時(shí)，速度為50RPM（注意：如果酶活性過低，可以延長孵育時(shí)間至 40 小時(shí)）31．小心倒掉消化液32．加入 50 毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里33．加入 毫升 GENMED 染色液（Reagent I），混勻34．室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育 60 分鐘，速度為 50RPM35．小心倒掉染色液36．加入 50 毫升用戶自備的無離子水到塑料盒里37．加入 毫升 GENMED 祛色液（Reagent J），混勻38．室溫下，平放在平式搖蕩儀上孵育 2 分鐘至 30 分鐘，速度為50RPM，直至可見深藍(lán)色背景下白色清安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文33晰的條帶（注意：避免過度去色）39．小心倒掉祛色液40．加入 毫升 GENMED 終止液（Reagent K）41．進(jìn)行拍照記錄或成像儀處理和半定量分析： 統(tǒng)計(jì)分析 所有數(shù)據(jù)以均數(shù)177。1 10顯微鏡下拍照，保存為 TIF 圖片格式后用 Image 軟件進(jìn)行測量，分析梗死面積占左室面積的百分比。蒸餾水或者去離子水洗 1min。所有資料均錄像后脫機(jī)分析，計(jì)數(shù)資料分別測量3個(gè)心動(dòng)周期取平均值。 主要儀器實(shí)驗(yàn)用小型呼吸機(jī)(HXQ1 型)多道電生理儀(成都儀器廠，RM6240 型)IE33 超聲心動(dòng)圖機(jī)(荷蘭，飛利浦公司)電熱恒溫水浴鍋 上海天平儀器廠隔水式電熱培養(yǎng)箱 江蘇東臺(tái)縣電器廠5415R 小型高速冷凍離心機(jī) 德國 Eppendorf 公司Minispin 小型離心機(jī) 德國 Eppendorf 公司超速離心機(jī) 德國 Beakman 公司托盤天平 上海第二天平儀器廠電子分析天平 上海奧豪斯公司安 徽 醫(yī) 科 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文23TSA 型脫色搖床 江蘇國勝實(shí)驗(yàn)儀器廠ZD9556 水平脫色搖床 江蘇省太倉科教器材廠冰凍切片機(jī) 德國 Leica 公司超低溫冰箱 日本 Sanyo 公司共聚焦顯微鏡 Zeiss 公司倒置顯微鏡 Olympus 公司水平電泳儀 北京東方特力電泳電源 BIORAD 公司電泳儀及附件 BIORAD 公司電轉(zhuǎn)儀及附件 BIORAD 公司微量移液器 Eppendorff 公司UMAX Powerlook