【文章內(nèi)容簡介】 定——愈創(chuàng)木酚法CAT活性的測定——紫外吸收法 抗旱性研究試驗于200907在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林實驗室進行，試驗開始將大葉冬青苗置于GXZ智能型光照培養(yǎng)箱（寧波江南儀器廠），光照度12 000 LX，溫度28℃。設(shè)4種脅迫處理：采用PEG6000溶于霍格蘭營養(yǎng)液，分別為CK(霍格蘭營養(yǎng)液)、S1(100 gL1)、 S2 (200 gL1)、S3(300 gL1)。每3天澆1次處理液，以澆透土壤為度。每個處理4盆（1株/盆），3次重復(fù)。試驗開始后每3天取樣1次，共采樣6次。取第l片完全展開葉下數(shù)的第3～8片葉，在液氮中迅速冷凍后置于70 ℃冰箱保存待測。 試驗方法葉綠素含量的測定——參照鄒琦（2000）的方法進行測定MDA——硫代巴比妥酸法SOD活性的測定——抑制氮藍四唑法（NBT）光化還原法POD活性的測定——愈創(chuàng)木酚法CAT活性的測定——紫外吸收法 實驗步驟(Chl)的測定分別將各處理的葉片清洗干凈吸干外附水分，剪碎后混勻。，記錄重量（W）。把葉片放到25ml的具塞試管中，然后加入10ml無水乙醇和10ml 80％的丙酮，搖勻后將試管放在黑暗的條件下浸提24小時。當(dāng)葉片組織完全變白時，以80%的丙酮作為對照測定在波長663nm、和645nm下的吸光度（OD）值，按下列公式計算出色素提取液的濃度：C（）＝+再根據(jù)下列公式計算色素含量：色素含量（）= C提取液體體積 W103葉綠素a的含量（Ca）＝（ A645）V/1000W葉綠素b的含量（Cb）＝（ ）V/1000W葉綠素總含量（C總）＝Ca+ Cb=（+）V/1000W其中：V ——提取液總體積（ml）W ——樣品鮮重（g） 電導(dǎo)率的測定儀器及用具：電導(dǎo)儀；水浴鍋；打孔器；大試管；紗布。試劑：去離子水；蒸餾水取各處理相同位、長勢一致的葉片，用去離子水沖洗干凈并用濾紙吸干外附水分，（避開葉主脈），將葉片用紗布包好放置于大試管底部，加入10ml的蒸餾水，并使之完全浸入水中。共測定3次電導(dǎo)率（1）1min后震蕩搖勻用電導(dǎo)儀測定電導(dǎo)值E0，（2）在室溫下放置24h后，充分搖勻測定電導(dǎo)值E1，（3）測完E1后，在沸水浴中加熱15min后，冷卻至室溫測定電導(dǎo)值E2，根據(jù)公式計算出相對電導(dǎo)率（L）。公式電導(dǎo)儀的常數(shù)：（1）檢查：調(diào)至： 常數(shù)為： 溫度： 25℃（2）測定時：先調(diào)至Ⅱ，測不出再調(diào)至Ⅲ。 統(tǒng)計軟件進行非線性回歸分析，用Logistic曲線擬合求出拐點溫度，作為半致死溫度(LT50)?？扇苄蕴堑臏y定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。蒽酮比色法原理：糖在濃硫酸作用下，可經(jīng)脫水反應(yīng)生成糠醛或羥甲基糠醛，生成的糠醛或羥甲基糠醛可與蒽酮反應(yīng)生成藍綠色糠醛衍生物，在一定的范圍內(nèi)，顏色的深淺與糖的含量成正比，故可用于糖的定量。儀器與用具：分光光度計；水浴鍋；刻度試管；刻度吸管一支；吸水紙適量。試劑：蒽酮乙酸乙酯試劑：取分析純蒽酮1克，溶于50ml乙酸乙酯中,貯于棕色瓶中,在黑暗中可保存數(shù)星期,如有結(jié)晶析出,可微熱溶解；濃硫酸。步驟 ：可溶性糖的測定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。取新鮮葉片，擦凈表面的污物，剪碎混勻，共四份。分別放入4支刻度試管中，加入10ml蒸餾水，用塑料薄膜封口，在沸水中提取30min，提取液過濾到25ml容量瓶中，重復(fù)提取——過濾過程一次。反復(fù)漂洗試管及殘渣，將過濾好的溶液稀釋4倍。，（重復(fù)三次），，充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，準(zhǔn)確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，在630nm波長下測其吸光度（A630）。吸取樣品液的體積提取液量稀釋倍數(shù)樣品干重106可溶性糖含量＝100％從回歸方程求得糖含量（SOD）活性的測定儀器與用具：高速離心機；分光光度計；熒光燈（反應(yīng)試管處光照強度為4000lx）試管數(shù)支；比色皿。試劑：()；130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液: 9g Met用磷酸緩沖液定容至100ml；750 u mol/L 氮藍四唑( NBT)溶液: 33gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100 u mol/L EDTANa2 溶液: 21g EDTANa2用磷酸緩沖液定容至1000ml；20u mol/L核黃素溶液: 53g核黃素定容至1000ml避光保存。方法：取比色皿，加入下列試劑表31 SOD反應(yīng)液組分表Table 31 The ponent of SOD reaction mixture試劑（酶）用量（ml）終濃度（比色時） PH=130mM Met溶液13mmol/L100uM EDTANa2液75μmol/L750uM NBT液10μmol/L20uM 核黃素酶液對照管以緩沖液代替酶液蒸餾水總體積將各管中的溶液混合均勻后，1支對照管放置在暗處，1支與酶液一起放入4000 Lx日照燈下反應(yīng)20min（各個試管受光要一致，溫度為25℃）。反應(yīng)結(jié)束后，用黑布遮蓋終止反應(yīng)。以不照光的對照管做空白，分別測定其它各管在560nm處的吸光值。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活單位表示，按下列公式計算SOD活性。SOD總活性=（ACK－AE）VACKWVt50%式中：ACK——照光對照管的吸光度AE——樣品管的吸光度V——酶液總體積（ml）W——樣品鮮重（g）Vt——反應(yīng)中加入的酶液體積（ml）（POD）活性的測定 采用Cutler JM（1980）的愈創(chuàng)木酚法方法進行測定，略加改動。儀器與用具：研缽；分光光度計。試劑：PH ；愈創(chuàng)木酚（%）；%的H2O2 方法步驟：在試管中加PH （）2 ml，愈創(chuàng)木酚（%），%的H2O2 ，空白以緩沖液代替。在470nm下測定其吸光值，加入酶液時開始計時，每隔30s讀數(shù)一次，連續(xù)記錄5分鐘。△A V△tμW酶活力 =式中：△A——吸光度的差值△t——反應(yīng)的時間差（min）W——樣品鮮重（g）V——反應(yīng)液體積（ml） μ——加入的酶液體積（ml）（CAT）活性的測定 采用湯章城（1998）的方法進行測定，略加改動。儀器：研缽；分光光度計。試劑：蒸餾水；=；30%的H2O2。=%的H2O2稀釋到250ml配置成CAT反應(yīng)液。，空白以緩沖液代替，總體積為3ml，在240nm下比色，加入酶液時開始計時，每隔10s讀取數(shù)據(jù)一次。△A V△tμW酶活力 = 式中：△A——吸光度的差值△t——反應(yīng)的時間差（min）W——樣品鮮重（g）V——反應(yīng)液體積（ml） μ——加入的酶液體積（ml）(MDA)含量的測定采用李合生（2000）的硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA ）的含量。儀器與用具：剪刀；離心機。試劑：5％的三氯乙酸；石英沙；％的硫代巴比妥酸。將待測葉片擦拭干凈，剪碎。，先加入2ml濃度為5％的三氯乙酸（TCA）和石英沙進行研磨。4ml 5％TCA沖洗轉(zhuǎn)移至離心管中；在3000r/min下離心10min，提取上清夜。取離心后的上清夜3ml，加入3ml ％的硫代巴比妥酸（TBA），混合后在沸水浴中煮沸30min，記錄體積（V0=6ml），冰浴下迅速冷卻，再離心10min。2ml蒸餾水+2ml %TBA混合液作為對照，分別測定上清夜在450nm、532nm、600nm處的吸光度A450 、A53A600。丙二醛含量（） ＝ [（A532－A600）－ A450] V W 式中：V——上清液體積（ml） W——樣品鮮重（g）用Office 200SPSS 。4結(jié)果與分析葉綠素總含量?？勺鳛橐环N反映逆境脅迫對植物造成傷害程度的生理指標(biāo)，用以說明環(huán)境條件的變化對植物產(chǎn)生的影響。因為許多逆境脅迫傷害植物的機理之一就是破壞了植物體內(nèi)自由基攻擊膜系統(tǒng)造成膜脂過氧化而引發(fā)植物生理代謝失調(diào)而受傷害(白寶璋等，1996)。緩慢降溫下葉片葉綠素含量的變化見圖41。圖41 緩慢降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化Fig41 Effect of slow cooling chill stress on chlorophyll content of broadleaf holly leaves 由圖41可知，0℃、6℃處理下大葉冬青植株葉片中葉綠素含量先降后升。這可能是大葉冬青為了維持正常的光合作用主動適應(yīng)低溫環(huán)境的結(jié)果,表現(xiàn)在葉綠素上就是其含量有所回升。植株在處理前24h 葉綠素含量都始終處于下降趨勢,在第48 h時0℃、6℃葉綠素含量開始回升。12℃、18℃處理下隨著低溫脅迫時間的延長葉綠素含量下降，即脅迫程度增加，葉綠素含量下降的幅度也增加。到72h時，12℃、18℃%、%，葉綠素含量下降明顯。驟然降溫下葉片葉綠素含量的變化見圖42圖42 驟然降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化Fig42 Effect of rapid cooling chill stress on chlorophyll content of broadleaf holly leaves由圖42可見，驟然降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化基本呈現(xiàn)下降的趨勢，但6℃、0℃處理下葉綠素含量變化不明顯，表明葉綠素含量對驟然降溫不敏感。0℃%，植株生長未受到影響。6℃處理下葉綠素含量下降幅度最多，受影響的程度也最大，在48h時葉綠素含量開始下降，%。細胞膜是防止細胞外物質(zhì)自由進入細胞的屏障，是細胞物質(zhì)交換的主要通道，對逆境傷害反應(yīng)比較敏感。在低溫脅迫下植物的細胞膜會遭到破壞，質(zhì)膜透性增大，從而使植物細胞的電導(dǎo)率增大，抗寒性較強的植物細胞不僅透性增大的程度較小，并且透性的變化可以逆轉(zhuǎn)，易于恢復(fù)正常（劉鵬，2004）。大葉冬青葉片在緩慢降溫下的相對電導(dǎo)率變化如圖43 所示。圖43 緩慢降溫下大葉冬青葉片相對電導(dǎo)率的變化Fig43 Effect of slow cooling chill stress on relative electrical of broadleaf holly leaves由圖43可以看出，隨著低溫脅迫時間的持續(xù)，四種低溫脅迫的電導(dǎo)率呈一致的變化趨勢，為“S”形變化曲線。在各低溫處理下24h 后電解質(zhì)滲出都不同程度的升高，溫度越低，電解質(zhì)滲出越多。 隨后，電解質(zhì)滲出曲線上升，在72h后，12℃、18℃處理下達到了最大值，%、%，上升幅度變化較大。0℃ 、 6℃在72h后與對照相比，變化不明顯，說明在6℃低溫下處理72h并未對大葉冬青葉片造成傷害。大葉冬青葉片在驟然降溫下的相對電導(dǎo)率變化如圖44 所示。圖44驟然降溫下大葉冬青葉片相對電導(dǎo)率的變化Fig44 Effect of rapid cooling chill stress on relative electrical of broadleaf holly leaves由圖44可見，驟然降溫下大葉冬青葉片電導(dǎo)率的變化同緩慢降溫時的變化趨勢基本一致，都呈雙峰的變化曲線，在脅迫24h時電導(dǎo)率變化最大，其中6℃處理變化明顯，%。6℃、0℃處理在整個過程變化幅度較小，%、%。此階段相對電導(dǎo)率下降可能與植物的自身調(diào)節(jié)有關(guān)。6℃處理的電導(dǎo)率在整個過程的變化均高于對照。由于電導(dǎo)率的大小表示細胞膜的破壞程度，說明驟然降溫下6℃低溫即對大葉冬青葉片造成了傷害。大部分研究者認為,植物材料在傷害度為50%時的脅迫因子的水平具有特殊的生理學(xué)意義，已廣泛應(yīng)用于抗性研究中。為了進一步確定與大葉冬青這個樹種的抗寒性有關(guān)的具有生理意義的低溫，對電解質(zhì)滲出率配以Logistic 方程,求得半致死溫度大葉冬青。緩慢降溫下大葉冬青葉片相對電導(dǎo)率隨處理溫度的變化見圖45。圖45 緩慢降溫下大葉冬青葉片相對電導(dǎo)率的變化Fig45 Effect of slow cooling chill stress on relative electrical of broadleaf holly leaves根據(jù)朱根海等(1986)有關(guān)組織半致死溫度的計算方法，可以計算出“S”形的拐點所對應(yīng)的溫度——即大葉冬青葉片組織的半致死溫度(LT50)，不同的處理時間“S”曲線的曲率不同。24h以上處理時間對應(yīng)的“S”形曲線可以計算出拐點溫度，℃℃之間(見表41)，這是大葉冬青抗寒能力的重要指標(biāo)。表41 不同處理時間大葉冬青半致死溫度LT50的計算Table41 LT50 of Broadleaf holly of different periods處理時間Treatment timeLogistic方程半致死溫度LT50（℃）擬合度R224 hY = / (1 + x)48 hY = 57. 465 / (1 + 69. 868 e0. 378 x) 11. 2372 hY = / (1 + x) 低溫脅迫下大葉冬青葉片MDA含量的變化 MDA是細胞膜脂過氧化的產(chǎn)物,其含量的高低反映了細胞膜脂過氧化水平。膜脂