【正文】 根據(jù)朱根海等(1986)有關(guān)組織半致死溫度的計(jì)算方法，可以計(jì)算出“S”形的拐點(diǎn)所對(duì)應(yīng)的溫度——即大葉冬青葉片組織的半致死溫度(LT50)，不同的處理時(shí)間“S”曲線(xiàn)的曲率不同。為了進(jìn)一步確定與大葉冬青這個(gè)樹(shù)種的抗寒性有關(guān)的具有生理意義的低溫，對(duì)電解質(zhì)滲出率配以L(fǎng)ogistic 方程,求得半致死溫度大葉冬青。由于電導(dǎo)率的大小表示細(xì)胞膜的破壞程度，說(shuō)明驟然降溫下6℃低溫即對(duì)大葉冬青葉片造成了傷害。此階段相對(duì)電導(dǎo)率下降可能與植物的自身調(diào)節(jié)有關(guān)。圖44驟然降溫下大葉冬青葉片相對(duì)電導(dǎo)率的變化Fig44 Effect of rapid cooling chill stress on relative electrical of broadleaf holly leaves由圖44可見(jiàn)，驟然降溫下大葉冬青葉片電導(dǎo)率的變化同緩慢降溫時(shí)的變化趨勢(shì)基本一致，都呈雙峰的變化曲線(xiàn)，在脅迫24h時(shí)電導(dǎo)率變化最大，其中6℃處理變化明顯，%。0℃ 、 6℃在72h后與對(duì)照相比，變化不明顯，說(shuō)明在6℃低溫下處理72h并未對(duì)大葉冬青葉片造成傷害。在各低溫處理下24h 后電解質(zhì)滲出都不同程度的升高，溫度越低，電解質(zhì)滲出越多。大葉冬青葉片在緩慢降溫下的相對(duì)電導(dǎo)率變化如圖43 所示。細(xì)胞膜是防止細(xì)胞外物質(zhì)自由進(jìn)入細(xì)胞的屏障，是細(xì)胞物質(zhì)交換的主要通道，對(duì)逆境傷害反應(yīng)比較敏感。0℃%，植株生長(zhǎng)未受到影響。到72h時(shí)，12℃、18℃%、%，葉綠素含量下降明顯。植株在處理前24h 葉綠素含量都始終處于下降趨勢(shì),在第48 h時(shí)0℃、6℃葉綠素含量開(kāi)始回升。圖41 緩慢降溫下大葉冬青葉片葉綠素含量的變化Fig41 Effect of slow cooling chill stress on chlorophyll content of broadleaf holly leaves 由圖41可知，0℃、6℃處理下大葉冬青植株葉片中葉綠素含量先降后升。因?yàn)樵S多逆境脅迫傷害植物的機(jī)理之一就是破壞了植物體內(nèi)自由基攻擊膜系統(tǒng)造成膜脂過(guò)氧化而引發(fā)植物生理代謝失調(diào)而受傷害(白寶璋等，1996)。丙二醛含量（） ＝ [（A532－A600）－ A450] V W 式中：V——上清液體積（ml） W——樣品鮮重（g）用Office 200SPSS 。取離心后的上清夜3ml，加入3ml ％的硫代巴比妥酸（TBA），混合后在沸水浴中煮沸30min，記錄體積（V0=6ml），冰浴下迅速冷卻，再離心10min。先加入2ml濃度為5％的三氯乙酸（TCA）和石英沙進(jìn)行研磨。試劑：5％的三氯乙酸；石英沙；％的硫代巴比妥酸。△A V△tμW酶活力 = 式中：△A——吸光度的差值△t——反應(yīng)的時(shí)間差（min）W——樣品鮮重（g）V——反應(yīng)液體積（ml） μ——加入的酶液體積（ml）(MDA)含量的測(cè)定采用李合生（2000）的硫代巴比妥酸法測(cè)定丙二醛（MDA ）的含量。=%的H2O2稀釋到250ml配置成CAT反應(yīng)液。儀器：研缽；分光光度計(jì)。在470nm下測(cè)定其吸光值，加入酶液時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，每隔30s讀數(shù)一次，連續(xù)記錄5分鐘。儀器與用具：研缽；分光光度計(jì)。SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活單位表示，按下列公式計(jì)算SOD活性。反應(yīng)結(jié)束后，用黑布遮蓋終止反應(yīng)。試劑：()；130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液: 9g Met用磷酸緩沖液定容至100ml；750 u mol/L 氮藍(lán)四唑( NBT)溶液: 33gNBT用磷酸緩沖液定容至100ml避光保存；100 u mol/L EDTANa2 溶液: 21g EDTANa2用磷酸緩沖液定容至1000ml；20u mol/L核黃素溶液: 53g核黃素定容至1000ml避光保存。，（重復(fù)三次），充分振蕩，立即將試管放入沸水浴中，準(zhǔn)確保溫1min，取出后自然冷卻至室溫，在630nm波長(zhǎng)下測(cè)其吸光度（A630）。分別放入4支刻度試管中，加入10ml蒸餾水，用塑料薄膜封口，在沸水中提取30min，提取液過(guò)濾到25ml容量瓶中，重復(fù)提取——過(guò)濾過(guò)程一次。步驟 ：可溶性糖的測(cè)定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。儀器與用具：分光光度計(jì)；水浴鍋；刻度試管；刻度吸管一支；吸水紙適量?？扇苄蕴堑臏y(cè)定采用蒽酮比色法（李合生，2000）。公式電導(dǎo)儀的常數(shù)：（1）檢查：調(diào)至： 常數(shù)為： 溫度： 25℃（2）測(cè)定時(shí)：先調(diào)至Ⅱ，測(cè)不出再調(diào)至Ⅲ。試劑：去離子水；蒸餾水取各處理相同位、長(zhǎng)勢(shì)一致的葉片，用去離子水沖洗干凈并用濾紙吸干外附水分，（避開(kāi)葉主脈），將葉片用紗布包好放置于大試管底部，加入10ml的蒸餾水，并使之完全浸入水中。把葉片放到25ml的具塞試管中，然后加入10ml無(wú)水乙醇和10ml 80％的丙酮，搖勻后將試管放在黑暗的條件下浸提24小時(shí)。 試驗(yàn)方法葉綠素含量的測(cè)定——參照鄒琦（2000）的方法進(jìn)行測(cè)定MDA——硫代巴比妥酸法SOD活性的測(cè)定——抑制氮藍(lán)四唑法（NBT）光化還原法POD活性的測(cè)定——愈創(chuàng)木酚法CAT活性的測(cè)定——紫外吸收法 實(shí)驗(yàn)步驟(Chl)的測(cè)定分別將各處理的葉片清洗干凈吸干外附水分，剪碎后混勻。試驗(yàn)開(kāi)始后每3天取樣1次，共采樣6次。每3天澆1次處理液，以澆透土壤為度。L1)、S3(300 g設(shè)4種脅迫處理：采用PEG6000溶于霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，分別為CK(霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液)、S1(100 g在6℃、0℃、6℃下，處理24h，采集成熟葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。試驗(yàn)將苗木在溫度21℃（4月份平均氣溫），光照強(qiáng)度為12 000 Lx，光照培養(yǎng)箱中，保持24h。分別在0℃、6℃、12℃、18℃下處理24h、48h、72h，采集成熟葉片進(jìn)行指標(biāo)測(cè)定。對(duì)苗木進(jìn)行低溫處理前先用光照培養(yǎng)箱進(jìn)行逐步低溫鍛煉，光照時(shí)間為7：30—19：30，光照強(qiáng)度為12000Lx，每天下降3℃，直至6℃時(shí)，穩(wěn)定3天。不同低溫處理后的苗木立即采樣測(cè)定葉片各項(xiàng)生理指標(biāo)，3次重復(fù)。試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)溫度處理，25℃（CK）、 0℃、6℃、12℃、18℃。定期澆霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液，每?jī)芍軡惨淮?，以澆透土壤為度? 試驗(yàn)方法200903下旬將大葉冬青二年生苗移栽至河南農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)場(chǎng)，直接入盆。本試驗(yàn)主要討論在低溫及干旱脅迫下，大葉冬青葉片的生理生化指標(biāo)的變化，為大葉冬青的引種栽培提供理論依據(jù)。近年來(lái)，由于世界氣候變化，一些雨水充沛的地方也發(fā)生了長(zhǎng)期干旱等極端氣候現(xiàn)象。因此鄭州地區(qū)引種大葉冬青，進(jìn)行抗寒性的研究具有重要的理論和實(shí)踐意義。不同低溫，不同低溫持續(xù)時(shí)間，溫度的下降速度等對(duì)大葉冬青造成的影響也各不相同。植物的低溫危害，表現(xiàn)為冷害和凍害，冷害為0 ℃以上的低溫引起，凍害則為0 ℃以下的低溫造成。因此引進(jìn)常綠闊葉樹(shù)種，對(duì)園林工作者來(lái)說(shuō)是一項(xiàng)重要的責(zé)任。河南屬北亞地帶與暖溫帶過(guò)渡型氣候，四季分明，雨量充沛，光照充足，地形復(fù)雜，氣候溫和有明顯的過(guò)渡性特征，南北方植物交匯并存。另外，大葉冬青也有很好的藥用價(jià)值，可消炎殺菌、健胃消積、清勢(shì)解毒、降血壓、降低膽固醇等藥用保健功能（文永新，1990；梁月榮，1992；劉祖生，1991；戴素賢，1998）。主要分布于長(zhǎng)江中下游各省及福建等地，河南南部大別山區(qū)有自然分布。這是因?yàn)槌趸镒杂苫倪^(guò)量生成超過(guò)了抗氧化酶系統(tǒng)的清除能力，從而造成活性氧類(lèi)物質(zhì)的累積，啟動(dòng)脂質(zhì)過(guò)氧化物，并進(jìn)入鏈?zhǔn)窖h(huán)反應(yīng)系統(tǒng)，同時(shí)產(chǎn)生類(lèi)似丙二醛（MDA）的脂質(zhì)氧化降解產(chǎn)物。 SOD、POD是機(jī)體清除超氧化物自由基或H2O2的酶類(lèi)。 干旱脅迫與植物保護(hù)酶系統(tǒng)的變化近年來(lái)，人們對(duì)干旱脅迫下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生以及活性氧對(duì)植物的傷害和植物抗氧化防御系統(tǒng)的作用進(jìn)行了大量研究，而堪稱(chēng)植物膜保護(hù)的三大酶系即超氧化物歧化酶(SOD)、過(guò)氧化物酶(POD)和過(guò)氧化氫酶(CAT)具有清除活性氧自由基的作用。唐連順（1994）等研究表明在干旱脅迫過(guò)程中玉米葉片質(zhì)膜透性明顯加大，且與MDA含量的變化呈顯著的正相關(guān)，這暗示膜脂過(guò)氧化增強(qiáng)是造成膜傷害的一個(gè)重要原因。 干旱脅迫與植物丙二醛（MDA）的變化植物器官衰老或遭受逆境，常會(huì)發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用，MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物之一，其積累是活性氧毒害作用的表現(xiàn)，目前常用MDA的含量作為脂質(zhì)過(guò)氧化的主要指標(biāo)。這說(shuō)明隨著干旱脅迫程度的加劇，黃櫨通過(guò)提高葉綠素含量保證對(duì)光能的充分利用，提高轉(zhuǎn)化率以保證碳同化，增強(qiáng)體內(nèi)的代謝活動(dòng)，這種生理反應(yīng)，是樹(shù)種抗旱能力的表現(xiàn)。劉玉英等（2007）測(cè)定了7個(gè)茶樹(shù)品種葉片中的葉綠素a和葉綠素b含量在干旱脅迫下的變化情況，結(jié)果表明各個(gè)茶樹(shù)品種的葉綠素a，b及總的葉綠素含量總體呈下降趨勢(shì)，并發(fā)現(xiàn)葉綠素b的下降速度要比葉綠素a的快，即葉綠素ａ/ｂ的值呈上升趨勢(shì)。 干旱脅迫與植物葉綠素含量的變化葉綠素總量主要包括葉綠素a(Chla)和葉綠素b(Chlb)，葉片葉綠素含量的變化，常被用作脅迫反應(yīng)的指標(biāo)。也有研究表明，干旱脅迫下樹(shù)木的根莖比沒(méi)有提高，甚至有所下降（Seiler J R，1985）。據(jù)研究，干旱脅迫下，樹(shù)木高、根莖系生長(zhǎng)、葉片數(shù)、葉面積及生物量、樹(shù)冠結(jié)構(gòu)等均受到抑制。PEG滲透脅迫法簡(jiǎn)單易行，條件容易控制，重復(fù)性好，試驗(yàn)周期短，適于大批量品種(系)苗期抗旱性早期鑒定。PEG是一種較為理想的滲透調(diào)節(jié)劑，許多研究者認(rèn)為用PEG模擬植物干旱逆境是可行的（Gergely I 1980；王翠花等2005）。這種方法簡(jiǎn)單易行，卻耗時(shí)費(fèi)力，只適用于小批量苗期抗旱性研究?！　∮梅Q(chēng)重法控制土壤含水量。都能使植物產(chǎn)生水分虧缺，特別是二者同時(shí)產(chǎn)生時(shí)，植物的水分虧缺將更為嚴(yán)重（湯章城，1999）。植物的水分虧缺是由于蒸騰失水超過(guò)吸水而產(chǎn)生的，即使在土壤水分充足的情況下，晴天的中午也常常產(chǎn)生干旱。由于連年干旱，雨量過(guò)少，每年降雨量約在200~300 mm，地下水位又較低，土壤中水分根本不能滿(mǎn)足植物生長(zhǎng)，如無(wú)灌溉，植物將受干旱之害。干旱的形成有兩種主要原因，并形成兩類(lèi)干旱。1997年在阿根廷召開(kāi)的“聯(lián)合國(guó)世界水大會(huì)”上，人們斷言：水將成為一個(gè)深刻的社會(huì)危機(jī)，世界上石油危機(jī)之后的下一個(gè)危機(jī)就是水危機(jī)（羅其友，1998）。干旱由于其發(fā)生頻率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，影響范圍廣、后延影響大，成為影響我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)最嚴(yán)重的氣象災(zāi)害之一。研究表明CAT活性低的植株中抗病相關(guān)蛋白表達(dá)量增加，抗病原菌的能力增強(qiáng)，在植物防御反應(yīng)及抗衰老過(guò)程中起重要作用。張國(guó)珍等（1997）認(rèn)為，POD區(qū)帶條數(shù)能在一定程度上反映植物抗寒性的大小，只能用其作為植物抗寒性比較的參照指標(biāo)。王榕楷等（2001）認(rèn)為，在不良的低溫條件下，植物的抗寒能力與植物體內(nèi)能否維持較高的SOD活性有關(guān)?；钚匝踉诘蜏孛{迫下積累，會(huì)在植物細(xì)胞膜系統(tǒng)上誘發(fā)膜脂過(guò)氧化作用，破壞膜結(jié)構(gòu)，使膜內(nèi)物質(zhì)向外滲漏，從而使植物遭受低溫傷害。沈紅波（2002）在杏品種抗寒性研究證明，可溶性糖含量，隨著處理溫度的降低，呈明顯增加趨勢(shì)，抗寒性強(qiáng)的品種增加的幅度越高。由此可以得出，MDA含量在低溫處理與對(duì)照之間的變化量可作為衡量植物的抗寒性的一個(gè)重要生理指標(biāo)。傅家瑞等（1986）在研究中發(fā)現(xiàn)，低溫使煙草葉片MDA含量明顯增加，并隨低溫脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)逐步升高的趨勢(shì)。在相同的低溫脅迫處理?xiàng)l件下，MDA含量高的品種抗寒性弱，反之則強(qiáng)。 丙二醛（MDA）與植物的抗寒性 MDA是膜脂過(guò)氧化的最終產(chǎn)物，是膜系統(tǒng)受傷害的重要標(biāo)志之一。經(jīng)過(guò)抗寒鍛煉， ℃℃，℃℃。 半致死溫度與植物的抗寒性低溫半致死溫度（LT50）是指在該溫度時(shí)，植物達(dá)到半致死狀態(tài)，當(dāng)溫度繼續(xù)低于該溫度時(shí)，植物所受的傷害將不可恢復(fù)甚至死亡，LT50是評(píng)價(jià)一個(gè)物種抗寒性強(qiáng)弱比較準(zhǔn)確的指標(biāo)(朱根海等，1986；羅正榮、章文才，1994；徐康等，2005)。電導(dǎo)率的變化反應(yīng)出質(zhì)膜受傷害程度和所測(cè)材料的抗寒性的大小。七十年Lyons L (1970)提出了“膜相變的寒害”假說(shuō)，認(rèn)為植物低溫冷害來(lái)自于膜脂物理性質(zhì)的改變，在低溫脅迫下植物細(xì)胞膜由液晶狀態(tài)變?yōu)槟z狀態(tài)，膜脂上的脂肪酸鏈也由無(wú)序排列變成有序排列，膜的外形和厚度都發(fā)生了變化，膜上產(chǎn)生龜裂，因而膜的透性增加以及膜結(jié)合酶結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致植物細(xì)胞內(nèi)生理代謝的變化和功能的紊亂，最終導(dǎo)致對(duì)植物體的傷害。葉綠素減少是對(duì)低溫脅迫的反應(yīng)，同時(shí)也可能是對(duì)長(zhǎng)期適應(yīng)低溫的響應(yīng)。低溫處理的初期(4 ℃，1 d和11℃ ，2d)，類(lèi)胡蘿卜素含量明顯下降，%%；但是在以后的脅迫期間內(nèi)其含量變化不大。 膜結(jié)構(gòu)功能的變化引起細(xì)胞代謝的改變低溫能引起一系列細(xì)胞代謝功能的改變，人們通常采用測(cè)定植物的葉綠素含量、膜透性、可溶性糖含量、丙二醛含量、SOD活性、POD活性、CAT活性等一系列生理特性來(lái)研究植物的抗寒性。②膜成分分析法。植物組織在經(jīng)低溫處理后，質(zhì)膜會(huì)受到傷害，細(xì)胞內(nèi)溶質(zhì)外滲增加，可以測(cè)定溶液的電導(dǎo)率來(lái)表示外滲電解質(zhì)的多少，植物受凍害越嚴(yán)重，則外滲物質(zhì)越多，電導(dǎo)率就越高，說(shuō)明細(xì)胞膜受傷害程度越嚴(yán)重，則林木抗寒性也就越差，反之，則植物抗寒性就越強(qiáng)。 細(xì)胞膜透性的研究現(xiàn)在主要采用的是電導(dǎo)法、膜成分分析法等。第二種是組織褐變法，通過(guò)觀(guān)察未受低溫處理組織的顏色和受低溫處理組織的顏色進(jìn)行對(duì)比，確定植物受傷害的程度。 生長(zhǎng)恢復(fù)試驗(yàn)法生長(zhǎng)恢復(fù)試驗(yàn)法包括生長(zhǎng)試驗(yàn)和組織褐變兩種。冰晶體會(huì)破壞生物膜、細(xì)胞器和襯質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)的隔離被破壞，酶活動(dòng)無(wú)秩序，影響代謝。當(dāng)溫度迅速下降時(shí)，除了在細(xì)胞間隙結(jié)冰以外，細(xì)胞內(nèi)的水分也會(huì)結(jié)冰，一般是先在原生質(zhì)內(nèi)結(jié)冰，后來(lái)在液泡內(nèi)結(jié)冰，這就是細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰。植物細(xì)胞外水分的過(guò)冷現(xiàn)象以及過(guò)冷現(xiàn)象詳細(xì)的分子機(jī)制，目前還尚未研究清楚。有些植物的某些組織中存在深度過(guò)冷現(xiàn)象，冰點(diǎn)可降到10～15℃。細(xì)胞內(nèi)水分的外流使細(xì)胞內(nèi)沒(méi)有可以結(jié)冰的水，同時(shí)胞外結(jié)冰的過(guò)程可以釋放熱量，在一定程度上緩解了細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰的壓力?！?