【文章內(nèi)容簡介】 酸鹽的情況下，miRNA399 表達上調(diào)，過量表達 miRNA399抑制其靶基因泛素結(jié)合酶 E2的積累從而增加了對磷酸鹽的吸收，miRNA399 可維持植物體內(nèi)的磷素平衡。miR398上調(diào)表達能夠提高作物在氧 化脅迫中的適應(yīng)性。miRNA廣泛參與了植物非生物逆境脅迫的響應(yīng)過程：miRNA159 受ABA誘導(dǎo)過量表達、miRNA393 受冷凍干旱鹽害和ABA的誘導(dǎo)都可表達、miR397 調(diào)控鹽脅迫相關(guān)的基因的表達、miR398在擬南芥生物和生物逆境中下調(diào)表達。miRNA 與植物抗氧化脅迫的關(guān)系主要來源于模式植物擬南芥miRNA398調(diào)控CuZn 超氧化物歧化酶（CSD) 基因的研究。實驗結(jié)果表明，氧化脅迫并不能誘導(dǎo) CSD1 和 CSD2 基因產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄水平的增加，這兩個CSD 基因的正調(diào)控取決于miRNA398 水平。當(dāng)植物處于氧化逆境脅迫下，miRNA398 的表達就會受到抑制，CSD轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累表現(xiàn)出植物的抗氧化能力。轉(zhuǎn)基因的研究進一步揭示了miRNA398在調(diào)控CSD 2 基因表達中和氧化脅迫中的重要作用。Sunkar 等構(gòu)建了擬南芥幼苗經(jīng)脫水、高鹽、低溫和 ABA脅迫處理后的小分子 RNA 文 庫，并對文庫的測序結(jié)果進行分析，發(fā)現(xiàn)26個未報道的 miRNAs，它們屬于15個新的 miRNA 家族。利用miRNA與靶基因結(jié)合序列互補的特點，預(yù)測了41個有不同功能的靶基因。Nothern Blotting結(jié)果表明，許多miRNA受到一種或多種逆境脅迫的調(diào)控這些調(diào)控有正有負，有組織特異性。miRNA393在逆境脅迫下靶向TIR1，表示脅迫處理可能會造成 TIR1 mRNA的降解或翻譯的抑制，而TIR1是生長素信號的正調(diào)控控子，作用在于促使泛素途徑降IAA/Aux蛋白，而對TIR1 mRNA 的抑制可負向的調(diào)節(jié)生長素信號和幼苗生長。故miRNA393 對 TIR1 的正調(diào)控有可能抑制逆境環(huán)境下植株的生長。Lu等從受到機械脅迫的毛果楊木質(zhì)部組織樣品中鑒別出5種與機械損傷相關(guān)的miRNA，如受張力和壓力下調(diào)表達的 miR15miR162 和miR164；受張力和壓力上調(diào)表達的miR408 ；受壓力增強表達的miR15受壓力下調(diào)表達的miR160和miR172以及受張力小幅下調(diào)表達的miR168。眾多研究數(shù)據(jù)表明miRNA在植物面對機械應(yīng)力狀態(tài)改變時有重要的調(diào)控作用。把miRNA 導(dǎo)入植物體內(nèi)也可以改變植物的表型：Achard等人發(fā)現(xiàn)過量表達miR159 可導(dǎo)致擬南芥在短日照下開花延遲、花粉囊發(fā)育受阻。還有報道稱擬南芥的2個miRNA基因的突變體miR164a和miR 164b的側(cè)根較多，其突變表型能夠被miR164a和miR164b基因的表達所恢復(fù)。 microRNA種類間存在協(xié)同作用關(guān)系多數(shù)情況下，MicroRNA并不是單一地發(fā)揮作用，往往需要多種microRNA與其它調(diào)控因子共同作用。MiR2l/let7和miR133/miR1這兩組的共現(xiàn)頻次最高，說明這兩組microRNA間存在密切協(xié)同作用關(guān)系。此外，miR1/miR499等相關(guān)研究也已經(jīng)引起研究人員的關(guān)注。 與microRNA研究密切相關(guān)的學(xué)科或研究方向 ：生物信息學(xué)是是80年代末隨著人類基因組計劃(HGP)的順利啟動和各種后基因組計劃的開始而興起的一門新興的交叉學(xué)科。它涉及生物學(xué)、數(shù)學(xué)、計算機科學(xué)和工程學(xué)等學(xué)科，是當(dāng)今生命科學(xué)和自然科學(xué)的重大前沿領(lǐng)域之一。：Hood給談?wù)撓到y(tǒng)生物學(xué)時指出，系統(tǒng)生物學(xué)是研究一個生物系統(tǒng)中所有組分（基因、mRNA、蛋白質(zhì)等）的構(gòu)成，及在特定條件下這些組分的相關(guān)關(guān)系，并通過計算生物學(xué)建立一個數(shù)學(xué)模型來定量描述和預(yù)測生物學(xué)功能、表型和行為的學(xué)科?，F(xiàn)在主流的系統(tǒng)生物學(xué)定義為：系統(tǒng)生物學(xué)是生物學(xué)的一個新領(lǐng)域，其目的在于在系統(tǒng)層次上理解生物系統(tǒng)，力求闡述作為一個系統(tǒng)的生物系統(tǒng)，并重點著眼于以下4個問題：①系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的闡述；②系統(tǒng)行為的分析；③系統(tǒng)控制的方法；④如何設(shè)計系統(tǒng)。:20世紀有三次偉大的科學(xué)革命，即相對論、量子力學(xué)和混沌。相對論排除了絕對空間和時間的牛頓幻覺、量子力學(xué)排除了對可控測量過程的牛頓迷夢、。混沌是非線性動力系統(tǒng)的特有運動形式。生物體本身就是一個非常復(fù)雜的非線性系統(tǒng)，生物的絕大多數(shù)過程中都有混沌效應(yīng)，比如神經(jīng)元突觸的分布、毛細血管的分叉、就連糖酵解的化學(xué)反應(yīng)中都存在混沌現(xiàn)象?？梢詫⒒煦缍x為非周期性的、具有漸進的自相似有序的現(xiàn)象。正常的自然條件下，植物在生長過程中不可避免地會出現(xiàn)很多生物與非生物因素的脅迫作用，鹽脅迫是影響植物生長主要非生物脅迫之一，本實驗試圖從miRNA角度進一步探索玉米受到鹽脅迫時的作用機理。 實驗流程玉米幼苗的萌發(fā)及幼苗的移栽 ↓玉米幼苗的鹽脅迫處理↓總RNA提取↓Real time PCR驗證↓數(shù)據(jù)及結(jié)果分析 材料與儀器 實驗材料、試劑、器皿及資料陜單6號玉米種子、蒸餾水、雙蒸水、無水乙醇、過氧化氫、硝酸鉀、硝酸銨、硝酸鈣、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、EDTA、硫酸亞鐵、Tris、SDS、氯仿、75%乙醇、氯化鋰、氯化鈉、異丙醇、瓊脂糖粉、CTAB、異戊醇、水飽和酚、TRNzolA+總RNA提取試劑（天根公司 產(chǎn)品目錄號：DP421）、One Step PrimeScript174。 miRNA cDNA Synthesis Kit（Takara code：D350A）； SYBR Premix Ex Taq II（Perfect Real Tim）（Takara code：DRR081 ）、液氮、研缽、研錘、量筒、燒杯、三角瓶、電泳槽、錫箔紙、保鮮膜、焦碳酸二乙酯、藍口瓶、藥匙、點樣緩沖液（Loading buffer）、一次性PE手套、一次性口罩。 實驗儀器核酸蛋白分析儀：Thermo Scientific ND1000（USA）；高速冷凍離心機：Eppendorf 5417R（Germany）；超低溫冰箱：Thermo Scientific Revco ULT（USA）；凝膠成像系統(tǒng)：BIORAD Gel Doc 2000（USA）；Realtime PCR儀：BIORAD CFX96（USA）；電泳儀：北京六一DYY12；70℃烘箱；180℃烘箱；液氮罐、制冰機、水浴鍋等按照Hoagland培養(yǎng)液的配比，配置培養(yǎng)液。成分如下表：全營養(yǎng)液中的大量元素：成分分子量使用濃度(mg/L)全營養(yǎng)液中的大量元素：硝酸鉀 KNO3101505硝酸銨 (NH4)2NO38080硝酸鈣 Ca(NO3)22361180磷酸二氫鉀 KH2PO3136136硫酸鎂 MgSO4*7H2O246492全營養(yǎng)液中的微量元素：成分分子量使用濃度(mg/L)微量元素碘化鉀 KI硼酸 H3BO3硫酸錳 MnSO4*4H2O硫酸鋅 ZnSO4*7H2O鉬酸鈉 Na2MoO4*2H2O硫酸銅 CuSO4*5H2O氯化鈷 CoCl2*6H2O鐵鹽乙二胺四乙酸二鈉 Na2EDTA硫酸亞鐵 FeSO4*7H2O選取籽粒飽滿、大小均一的玉米種子用3%的H2O2浸泡15min，用蒸餾水將玉米及其殘留沖洗干凈。于25℃ 蒸餾水中浸泡68h。在兩層紗布上將玉米種子均勻的擺好，其上再蓋一層紗布，用蒸餾水將紗布打濕，等待萌發(fā)。期間加水一次，但是水不能太多保持紗布的濕潤、傾斜容器水不宜流出即可。待種子萌發(fā)后根部大約12cm長時將種子疏松擺放在雙層濕潤紗布上，注意保證紗布水分充足。當(dāng)玉米芽長到2cm時，小心用棉花包裹種子，注意留出根部，插入自制玉米水培盆小孔中（直徑1cm左右）。于蒸餾水中培養(yǎng)2d后換Hoagland培養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉期挑出長勢一致的玉米幼苗做處理。玉米幼苗在低濃度鹽脅迫下不受到鹽害或受鹽害較輕，故這時所表現(xiàn)出來的差異不一定是鹽脅迫處理的結(jié)果。NaCl 溶液濃度小于50mmolL1（）的鹽濃度均不適于作為玉米苗期鹽脅迫處理的鹽濃度；而當(dāng)NaCl 溶液濃度大于350mmolL1() 時，大部分幼苗均受害嚴重而死亡；只有NaCl 溶液濃度在50～350 mmolL1 范圍內(nèi)，玉米幼苗受鹽害比較明顯又不致死。本實驗選取生長狀況良好、相似的玉米幼苗，每個處理三株幼苗，每株幼苗取較大兩片葉子邊緣3cm作為材料。設(shè)定5%（質(zhì)量分數(shù)）、10%、20%三個梯度處理濃度，設(shè)定3h、6h兩個時間梯度，并設(shè)空白對照。 總RNA的提取 CTABLiCl法提取總RNA（，%CTAB， 2%PVP，2% β巰基乙醇，其中巰基乙醇可在使用前加入）。SSTE(%SDS，10mmol/LTris%DEPC水處理并高壓滅菌，含Tris的溶液用高壓滅菌后的DEPC水直接配制。，塑料制品等于DEPC水中浸泡1夜后高壓滅菌。，劇烈震蕩混勻，室溫靜置20min。℃條件下，12000rcf離心10min，并取上清置于新離心管中。（25：24：1），輕柔顛倒混勻，冰上放置10min?！鏃l件下，12000rcf離心10min，并取上清置于新離心管中。每管加入1/20體積4mol/L醋酸鉀（），1/10體積的無水乙醇，輕柔混勻。再加入相同體積的氯仿/異戊醇（24：1），輕柔混勻，冰上放置10min?！鏃l件下，12000rcf離心10min，并取上清置于新離心管中。，使LiCl最終濃度達到2mol/L，4℃過夜?！鏃l件下，12000rcf離心10min，棄上清，用75%乙醇洗沉淀，棄乙醇并加入SSTE緩沖液溶解沉淀，加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）抽提，轉(zhuǎn)移上清至新離心管中，加入2倍體積無水乙醇，20℃靜置2h?！鏃l件下，12000rcf離心10min,棄上清，75%乙醇洗沉淀，棄乙醇并在超凈臺上晾干，加入30mlDEPC水完全溶解，70℃保存。 SDS法提取總RNA(50mmol/L Tris ，150mmol/L LiCl，5mmol/L EDTA，5%的SDS)。，震蕩混勻，直至看不到任何團狀沉淀物。（1：1），劇烈倒置混勻10min?！鏃l件下，12000rcf離心5min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管中。，加入等體積的氯仿，反復(fù)倒置混勻5min。℃條件下， 12000rcf離心5min，取上清轉(zhuǎn)入新離心管中。，4℃過夜。℃條件下， 12000rcf離心10min，棄上清，保留沉淀。：（7：3）的混合液洗沉淀?！鏃l件下，12000rcf離心2min。%乙醇洗沉淀2次，以去除鹽離子。棄乙醇并在超凈臺上晾干，加入30mlDEPC水，完全溶解沉淀，70℃保存。 TRNzolA+法提取總RNA，并加入1毫升TRNzolA+ min，使得核酸蛋白復(fù)合物完全分離?！鏃l件下 13400 rcf 離心10 min，取上清。 ml TRNzolA+加入200微升氯仿，蓋好管蓋，劇烈振蕩15 sec，室溫放置3 min℃條件下13400rcf 離心15 min。樣品會分成三層：黃色的有機相，中間層和上層無色的水相，RNA主要在水相中，把水相（約500 微升）轉(zhuǎn)移到新管中。，混勻，室溫放置2030 min。℃條件下13400