【文章內(nèi)容簡介】 烏作為古老的稀有物種和重要經(jīng)濟(jì)植物，需要得到很好的保護(hù)。真正要保護(hù)一物種，不是保護(hù)一定數(shù)量的該物種就達(dá)到目的，而是要盡可能多保護(hù)該物種的遺傳變異。然而，對于何首烏的遺傳變異水平和群落結(jié)構(gòu)卻一無所知，何首烏變異的研究仍停留在形態(tài)上的描述，要確定形態(tài)上的差異是由于生態(tài)條件造成的還是遺傳性所決定的，就必須研究種內(nèi)的遺傳變異，分子生物學(xué)的方法將是有力的工具，如采用同工酶、RAPD技術(shù)等，只有在確定了遺傳多樣性和變異類型的基礎(chǔ)上，才能有效而全面保護(hù)何首烏，同時(shí)，采用遷地保護(hù)的辦法復(fù)壯那些頻率低、稀有的基因。(1902 年)，德國植物學(xué)家GHaberlandt 最早開始植物組織培養(yǎng)的研究，至今已有90余年, 隨著生產(chǎn)和科學(xué)水平的提高，植物組織培養(yǎng)技術(shù)已達(dá)到了一定的精確度。研究的領(lǐng)域從植物生理學(xué)科逐漸擴(kuò)展到細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)、園藝學(xué)、育種學(xué)等學(xué)科。特別是近20 年來，在理論與應(yīng)用上的重要性日益顯著發(fā)展到細(xì)胞器培養(yǎng)，原生質(zhì)融合培養(yǎng)以及當(dāng)前迅猛發(fā)展的DNA重組技術(shù)。從理論上可以研究探討細(xì)胞生長、分化的機(jī)理及其有關(guān)的細(xì)胞生理學(xué)和遺傳學(xué)等問題。同時(shí),由于生產(chǎn)實(shí)踐不斷提出新的要求，又促使了理論研究與生產(chǎn)有機(jī)地結(jié)合起來，更使植物組織培養(yǎng)成為一項(xiàng)大有發(fā)展前途的技術(shù)。何首烏極高的藥用、食用、保健醫(yī)療價(jià)值，引發(fā)人們?yōu)E采濫挖，以采集野生為主供應(yīng)市場。盲目采挖之風(fēng)使野生資源廖廖無幾，難覓蹤跡，幾近滅絕，更顯珍貴。近年何首烏市場價(jià)格一直穩(wěn)中有升，供不應(yīng)求，很多地方出現(xiàn)了有價(jià)無貨的局面。因此，發(fā)展人工栽培何首烏前景看好。通過組織培養(yǎng)等手段進(jìn)行何首烏的栽培與繁殖，能達(dá)到快速繁殖的目的，以滿足市場上的需要。、目的和意義 研究內(nèi)容本次研究取何首烏的幼嫩葉片為外殖體，通過調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中2，4D、6BA的不同濃度，研究激素配比對何首烏葉片誘導(dǎo)分化的影響，以期能得到較優(yōu)化的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方。 研究目的本課題研究目的主要有以下幾方面：（1）、通過對何首烏幼嫩葉片組織培養(yǎng)中不同濃度配比，得到最佳的誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基配方。（2）、掌握組織培養(yǎng)相關(guān)知識，熟悉相關(guān)操作。 研究意義何首烏，是云臺山盛產(chǎn)的藥材之一，屬蓼科多年生草藤植物，是中藥材中用量較大的品種之一，多年來一直是受關(guān)注的品種。鑒于其起源古老，在科學(xué)上具有重要研究價(jià)值及其重要的藥用價(jià)值，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)的稀有植物。何首烏傳統(tǒng)用藥的經(jīng)驗(yàn)是用其塊根，其功效有補(bǔ)肝、益脾、養(yǎng)血祛風(fēng)，常用于肝腎陰虧，須發(fā)早白，血虛頭暈等癥，亦能治瘡癢、疥癬等皮膚病。何首烏大部分為野生，由于該產(chǎn)品多為塊根繁殖，是一種生長周期較長的草藤植物,一般需要3～4年才能采挖。近年來， 隨著科學(xué)進(jìn)步的不斷發(fā)展，何首烏的用途迅速拓寬，該品不但被眾多中成藥企業(yè)看好，同時(shí)亦是化工和保健品的重要生產(chǎn)原料。據(jù)悉，目前市場上80%以上的洗發(fā)液、洗發(fā)膏均含有何首烏成分；50%以上的護(hù)肝、補(bǔ)腎中成藥及保健產(chǎn)品含有何首烏原料。隨著國內(nèi)國際市場對何首烏的需求逐年增加，產(chǎn)區(qū)群眾在利益的驅(qū)動下，一哄而起，連年采取地毯式的濫采濫挖，掘地三尺，甚至連幼根也不放過，使野生資源遭到嚴(yán)重破壞，野生何首烏的產(chǎn)量每年遞減20%左右。何首烏產(chǎn)量的逐年下滑，庫存空虛及市場需求的有增無減，使得“物以稀為貴”，造成何首烏價(jià)格暴漲。由于何首烏用量逐年增大，但資源卻日趨枯竭，瀕臨絕跡。因此保護(hù)何首烏資源已迫在眉睫。而植物組織培養(yǎng)具有生長周期短，繁殖率高，成本低，利于工廠化等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此利用現(xiàn)代生物工程技術(shù)——植物組織培養(yǎng)，能夠很好的保護(hù)何首烏資源。2　材料與方法 實(shí)驗(yàn)用品材料：初生2～3周何首烏幼嫩葉片；藥品：硝酸鉀、硝酸銨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、碘化鉀、硼酸、硫酸錳、硫酸鋅、鉬酸鈉、硫酸銅、氯化鈷、乙二胺四乙酸二鈉、硫酸亞鐵、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸、蔗糖、瓊脂、2,4D、6BA器皿和工具：刀，培養(yǎng)皿，錐形瓶，托盤天平，分析天平，燒杯，電爐，玻棒，試管，酒精燈，長柄鑷子，貼標(biāo)紙，記錄筆，牛皮紙，細(xì)繩。主要設(shè)備：手提式不銹鋼蒸汽滅菌鍋 型號：YX280B 接種臺 型號：DH500AB 冰箱 型號：BCD2425 實(shí)驗(yàn)材料的采集2011年3月底，在攀枝花學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院植物園采集何首烏葉片。選取靠近葉稍的幼嫩葉片，葉片生長2～3周，葉片顏色剛開始由淺綠轉(zhuǎn)深綠為最好。采集回來的葉片用清水沖洗后放入冰箱備用，準(zhǔn)備實(shí)驗(yàn)。在超凈臺上，將葉片放入廣口瓶中，先用75%的乙醇將葉片浸泡1030s，并不時(shí)搖動玻璃瓶。然后倒出酒精，注入無菌水，再蓋上蓋，搖動數(shù)次，將水倒掉，如此反復(fù)數(shù)次。%HgCl2溶液，使葉片完全浸沒在溶液中，蓋上蓋，并不時(shí)搖動玻璃瓶，待8分鐘后倒出溶液，加入無菌水，再蓋上蓋，搖動數(shù)次，將水倒掉，如此反復(fù)數(shù)次。在超凈臺上按無菌操作要求（超凈臺先用紫外燈滅菌30min），用70%酒精棉球擦手與器具外壁。逐一取出經(jīng)上述滅菌處理的植物材料，置于下面墊有經(jīng)滅菌處理的培養(yǎng)皿（或小白瓷碟）的無菌紗布或?yàn)V紙上，左手拿小鑷子，右手拿解剖刀，切除各切段或切塊上被滅菌劑毒壞的部分。用解剖刀將葉片切成規(guī)整的5mm5 mm的小葉塊，在完成一次切割后，將解剖刀和小鑷子在95%乙醇中浸蘸一下，在酒精燈焰上灼燒滅菌之后放回原處，以便待冷卻后下一切割再用（棄去開始一片和最后一片）。本實(shí)驗(yàn)采用MS+2,4 D 的（不定）mg/L+6BA(不定)mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂20g/L培養(yǎng)基。培養(yǎng)基配制程序如下：（1）、玻璃器皿的清洗、消毒。先將器皿進(jìn)行高溫高壓消毒，在用洗滌劑清洗干凈，倒置于架子上晾干，然后轉(zhuǎn)入烘箱中，在80～140下烘烤2小時(shí)，最后轉(zhuǎn)入防塵櫥或直接使用。（2）、MS母液配制。按MS培養(yǎng)基母液配制要求，配制MS大量元素母液（10倍），MS微量元素（1000倍）、MS有機(jī)母液（100倍）、MS鐵鹽母液（100倍）各1000ml(表一)，倒入磨口試劑瓶中，放在4℃冰箱中待用。注意的是MS鐵鹽母液應(yīng)用棕色磨口瓶裝，并使其在室溫下充分反應(yīng)后，再轉(zhuǎn)入4℃冰箱中保存。（3）、激素母液（表二）配制。激素母液2,4D（, mg/L）擴(kuò)大100倍各配制1000ml倒入磨口試劑瓶中放入4℃冰箱中待用；6BA按使用濃度（,）擴(kuò)大100倍各配制1000ml，倒入磨口試劑瓶中，放在4℃冰箱中待用。注意2,4D先用1mol/L氫氧化鈉溶解，再用蒸餾水定容；6BA先用少量1mol/L鹽酸溶解，再用蒸餾水定容。（4）、培養(yǎng)基的配制。配制1L培養(yǎng)基主要包括以下五步：第一，用量筒量取700～800ml蒸餾水，；第二，按比例依次加入MS大量元素母液（100ml），MS微量元素母液（1ml），MS有機(jī)母液（10ml），MS鐵鹽母液（10ml）。每加一種母液都要混合均勻，然后才加入第二種母液；第三，將燒杯再電爐上加熱到70℃左右，將稱好的瓊脂（20g）、蔗糖（30g）依次加入，繼續(xù)加熱至瓊脂全部融化；第四，按設(shè)計(jì)方案加入激素母液（表2）配制成實(shí)驗(yàn)所需的不同培養(yǎng)基。（5）、分裝。待稍微冷卻，按每瓶20ml培養(yǎng)基分裝到錐形瓶內(nèi)，再用耐高溫高壓的塑料膜或牛皮紙封口，最后用線或橡皮筋扎緊，準(zhǔn)備滅菌。（6）、滅菌。將準(zhǔn)備好的培養(yǎng)基裝入高壓滅菌鍋20～30min，然后取出平放在實(shí)驗(yàn)架上冷卻。注意滅菌過程的安全，實(shí)驗(yàn)前腰仔細(xì)檢查鍋內(nèi)水位、鍋上的壓力表、安全閥的是否正常。 培養(yǎng)基滅菌實(shí)驗(yàn)室用的高壓滅菌鍋是手提式不銹鋼蒸汽消毒器。高壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的加壓滅菌鍋內(nèi)，通過加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸氣。待水蒸氣急劇地將鍋內(nèi)的冷空氣從排氣閥中驅(qū)盡，然后關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱，此時(shí)由于蒸氣不能溢出，而增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力，從而使沸點(diǎn)增高，得到高于100℃的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。整個(gè)滅菌過程的具體操作步驟如下]:（1）加水 高壓蒸汽滅菌鍋，將里面的滅菌桶取出，向鍋內(nèi)加水，使水面與底架平齊。（2）裝料 將滅菌桶放回滅菌鍋，裝有培養(yǎng)基的錐行瓶和裝有純凈水的錐形瓶瓶口向上豎放在滅菌桶內(nèi)，實(shí)驗(yàn)用器具等清洗干凈后用報(bào)紙包扎好后也一并放入滅菌桶內(nèi)，物品之間要保留空隙，以利于通氣。（3）密封 加蓋，將排氣軟管插入滅菌鍋的排氣管內(nèi)。以對角的方式，同時(shí)擰緊相對的兩個(gè)緊固螺栓，以防止漏氣。（4）排氣 檢查安全閥和排氣閥是否關(guān)閉，接通電源，加熱，當(dāng)壓力上升到一定程度時(shí)(49KPa左右)，打開排氣閥放氣，當(dāng)壓力降到0時(shí)，關(guān)閉排氣閥。重復(fù)上述放氣過程一次，以徹底排出鍋內(nèi)的冷空氣。（5）升壓 母種培養(yǎng)基和原種培養(yǎng)基滅菌時(shí)當(dāng)鍋內(nèi)的溫度上升到121℃，保持20min。栽培培養(yǎng)基126℃（）保持150min。（6）降壓 停止加熱，讓其自然降壓。當(dāng)壓力降至0以后，打開排氣閥，相隔一定時(shí)間后，擰開緊固螺栓，取出錐形、平板和試管。最后待將滅菌鍋冷卻后，把滅菌鍋內(nèi)的水排放干凈。將滅菌處理后的錐形瓶一起放進(jìn)無菌工作室。待試管冷卻到50℃左右時(shí)，等