帕金森病病人usp24基因外顯子39～68突變篩查的論文(編輯修改稿)
2025-07-21 21:18 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 parkin、pink1與dj1基因均無突變(結(jié)果來源于唐北沙教授課題組)?！ ?正常對(duì)照組 95例，分別由醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及中南大學(xué)湘雅醫(yī)院收集。其中男50例，女45例。平均年齡為(177。)歲。性別、年齡、居住地、民族分布均與pd病人組相匹配?！ ?方法 外周血gdna抽提 常規(guī)采集兩組外周靜脈血10 ml，受檢者均簽署知情同意書。常規(guī)苯酚氯仿法抽提外周血淋巴細(xì)胞gdna。 引物設(shè)計(jì) 對(duì)usp24基因exon39～68以及這些外顯子與內(nèi)含子的交界區(qū)進(jìn)行pcr擴(kuò)增。采用primer (bin/primer/)設(shè)計(jì)相應(yīng)的pcr引物(序列見表1)，引物由上海博亞生物技術(shù)有限公司合成。表1 usp24基因突變檢測(cè)引物序列外顯子正向引物反向引物 pcr反應(yīng)條件 采用熱啟動(dòng)pcr反應(yīng)程序在10 μl反應(yīng)體系中擴(kuò)增各對(duì)引物，反應(yīng)體系如下： 5106 u/l的hotstar polymerase (qiagen公司) μl，10 mmol/l dntps μl，30 mg/ μl，30 mg/l dna 模板 μl，10buffer μl，q buffer μl，mgcl2 μl，補(bǔ)去離子水至10 μl。多數(shù)引物的pcr反應(yīng)程序?yàn)椋旱谝幌嘌h(huán)，95 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性50 s, 65 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)6次，每個(gè)循環(huán)退火溫度下降1 ℃。第二相循環(huán)，94 ℃變性50 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸50 s，循環(huán)25次，72 ℃延伸5 min。 μl用60 g/l聚丙烯酰胺凝膠電泳40 min，并銀染檢測(cè)，對(duì)擴(kuò)增特異性好的pcr產(chǎn)物用蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶(fermant公司)37 ℃酶切90 min, 80 ℃ 15 min滅活蝦堿性磷酸酶和核酸外切酶，將處理后的pcr產(chǎn)物使用3100基因分析儀(abi公司)進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用dnastar軟件中的seqman程序與參照序列(genebank accession number：)進(jìn)行比對(duì)分析?！ ?統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用spss ’s exact test分析等位基因頻率和基因型頻率在兩組間的差別
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