【文章內(nèi)容簡介】 中深藍色顆粒浸潤即為死亡細胞，透亮的則為活細胞。4滴樣品各隨機取視野計算100個細胞，細胞存活率=活細胞數(shù)／100。把4個數(shù)值平均，即為某一天細胞的存活率，總細胞數(shù)x存活率即得某天的活細胞數(shù)。 基因瘤苗荷瘤試驗把基因瘤苗按是否照射60Co，分為兩組：照射組和未照射組，注射瘤苗細胞懸液于裸鼠側(cè)背部皮下，進行荷瘤試驗，每組六只裸鼠，密切觀察兩組裸鼠生長狀況，看是否長出移植瘤（具體的步驟見下面“裸鼠移植瘤模型的建立”）。實驗分兩組：照射60Co轉(zhuǎn)染IL2的COLO205瘤苗細胞組和照射60Co轉(zhuǎn)染IL2的COLO205細胞組,每組6只裸鼠，共12只。 體內(nèi)實驗檢測基因瘤苗的抗腫瘤效應(yīng)。 結(jié)腸癌細胞系COLO205裸鼠移植瘤模型的建立1) Balb/c裸小鼠12只，鼠齡4～5周，體重15～25g，購于中國科學院上海實驗動物中心。裸鼠飼養(yǎng)于無菌室層流架無特定病原體(SPF)環(huán)境中，給予高壓滅菌的水和飼料自由食用。2) COLO205大腸癌細胞生長至亞融合狀態(tài)時，棄完全培養(yǎng)液，PBS洗滌3， %typsin/% EDTA消化成單細胞懸液，800 rpm5 min，4℃離心；用PBS重懸細胞，細胞數(shù)調(diào)整至1108/ml。3) 在每只裸小鼠側(cè)背部皮下注射腫瘤細胞懸液50μl(5106細胞)。4) ，實驗分為兩組：治療組和對照組。應(yīng)用我們制備的轉(zhuǎn)導(dǎo)了IL2基因的COLO205瘤苗對腫瘤組織行瘤內(nèi)注射，對照組注射PBS。 基因瘤苗治療移植瘤把制備好經(jīng)檢測高表達的轉(zhuǎn)染IL2人大腸癌COLO205細胞基因瘤苗進行復(fù)蘇，復(fù)蘇后基因瘤苗細胞存活率達到80%以上，待細胞生長至亞融合狀態(tài)，進行安全型處理后（用60Gy60Co照射)為治療組，對照組為PBS。,進行治療試驗。治療組向移植瘤內(nèi)注射基因瘤苗（細胞量大約為1107個/每只裸鼠，制成細胞懸液），對照組為PBS,兩組液體體積相等，每隔1周注射一次。從首次注射之日起密切觀察兩組裸鼠生長狀況，每隔3天用游標卡尺檢測腫瘤長徑和短徑，計算并比較腫瘤的體積。計算公式為腫瘤體積：V=π[(長徑＋短徑)/2]3/6。兩組間體積比較采用t檢驗，EXCEL 、。 移植瘤的處理觀察5周后處死小鼠，解剖裸鼠，取出腫瘤稱重，OCT包埋，冰凍切片機切片，免疫組化檢測IL2的表達。兩組間重量比較采用t檢驗。免疫組織化學檢測：1) 冰凍切片經(jīng)冷丙酮室溫固定30分鐘后，TBS洗5分鐘。2) ％的H2O237℃孵育20分鐘，以去除內(nèi)源性的過氧化物酶活性。3) TBS洗5分鐘，1:20正常羊血清37℃封閉30 min。4) 加入一抗37℃孵育2h。5) TBS洗3遍后加入HRP標記的二抗37℃孵育1h，6) TBS洗3遍，DAB顯色，顯微鏡下控制顯色時間，約510分鐘，蘇木素襯染細胞核后封片觀察。3 結(jié)果 ELISA檢測IL2蛋白水平得表達 ELISA檢測IL2蛋白水平得表達結(jié)果如表1表示。其中IL2表達最高的克隆是編號為COLO205H5混合克隆， ng/1107/24h，表達最高的單克隆編號為COLO20511， ng/1107/24h， ng/1107/24h。未轉(zhuǎn)染IL2的三個結(jié)腸癌細胞株培養(yǎng)液上清中均未檢測到IL2的表達。細胞株總體IL2表達克隆數(shù) 范圍 平均值單克隆IL2表達克隆數(shù) 范圍 平均值混合克隆IL2表達克隆數(shù) 范圍 平均值SW11621 0～ 21 0～ / / /HT2924 ～ 22 ～ 2 ～ COLO20516 0～ 11 0～ 5 ～ 表1 基因轉(zhuǎn)導(dǎo)大腸癌細胞株IL2的表達情況（單位：ng/1107/24hr）(schedule 1 state of gene transducted colorectal cancer cell strain express IL2 unity：ng/1107/24h) 瘤苗細胞的安全性檢測結(jié)果 照射60Co對瘤苗細胞活力的影響經(jīng)60Co照射后基因瘤苗細胞體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)隨天數(shù)的增加，細胞存活率下降，活細胞數(shù)減少，照射后一周內(nèi)細胞的存活率約為50％，25天內(nèi)基因細胞瘤苗全部死亡，結(jié)果見表2（同種細胞兩株細胞的活力檢測的結(jié)果）。上述結(jié)果表明照射后的細胞活力明顯下降，在第15天時候細胞幾乎全部死亡，因此，經(jīng)60Co照射后瘤苗細胞已經(jīng)失去了腫瘤性的無限增殖能力，失去了致瘤性。 劑量 天數(shù)60Gy1 3 6 8 10 13 15 20 25 存活率（℅） 100 97 53 28 8 2 0 100 95 52 25 5 1 0表2 照射60Co對瘤苗細胞活力的影響(schedule 2 influence of radiation tumor vaccine with 60Co) 體內(nèi)實驗檢測瘤苗的安全性未照射60Co基因瘤苗組在第16天出現(xiàn)了腫瘤，而照射組未能成瘤,見圖1。體內(nèi)和體外實驗均說明了我們應(yīng)用60Co處理過瘤苗細胞已失去腫瘤細胞的無限增殖的能了，失去了致瘤性，用來治療腫瘤是安全可行的。 A 未照射60Co B 照射60Co 圖1 兩組瘤苗細胞的荷瘤實驗結(jié)果(graph 1 result of two group tumor vaccine cell bearing tumor ) 體內(nèi)實驗研究瘤苗的抗腫瘤效應(yīng) 治療組給予基因瘤苗后移植瘤生長速度明顯慢于對照組，對照組裸鼠生長狀態(tài)較差，腫瘤體積不斷增大，在第31天時已有2只裸鼠不能耐受而死亡。治療組裸鼠生長狀況較為良好，在第22天時腫瘤生長已經(jīng)達到平臺期。在第31天時處死所有裸鼠，取瘤稱重。從治療之日起，移植瘤的生長曲線見圖2，兩組間體積比見表3。處死裸鼠后取腫瘤，兩組間移植瘤重量的比較見表4。(graph 2 growth curve of transplantation tumor)時間點（每隔3天） 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11治療組（裸鼠的平均體積） 785 980 1134 1258 1431 1569 1892 2051 2154 2167 2181對照組（裸鼠的平均體積） 821 1121 1457 1793 2234 2794 3685 4005 4451 4921 5011t= P表3. 移植瘤體積比(schedule 3 volume ratio of transplantation tumor)組 別 1 2 3 4 5治療組 對照組 t= P 表4 移植瘤重量比(schedule 4 weight ratio of transplantation tumor) 移植瘤的免疫組化腫塊經(jīng)OCT包埋制成冰凍切片后進行免疫組織化學檢測。結(jié)果顯示治療組移植瘤內(nèi)IL2表達呈強陽性，而對照組移植瘤內(nèi)IL2為表達為陰性，見圖3。說明基因瘤苗在移植瘤內(nèi)存活，并能繼續(xù)分泌IL2。 A 對照組 B 治療組 圖3. 兩組間的組免疫組化(graph 3 immunohistochemistry of two groups )