pcr的定義、歷史與運(yùn)用(編輯修改稿)
2025-07-18 13:03 本頁面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 區(qū)。（二）分裝試劑：PCR擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴(kuò)增后的DNA和其他來源的DNA： 1．PCR用水應(yīng)為高壓的雙蒸水； 2．引物和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制； 3．引物和dNTP應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。 (三)實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意： 1.戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套； 2.使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染； 3.避免反應(yīng)液飛濺，打開反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面； 4.操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度； 5.最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管； 6.操作時(shí)設(shè)立陰陽性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性； 7.盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)； 8.重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。 二．追蹤污染源 如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。 （一）設(shè)立陰陽性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣品，因強(qiáng)陽性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。 （二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可能性外，更換試劑后，若不久又發(fā)現(xiàn)試劑被污染了，如果預(yù)防措施比較嚴(yán)密，則考慮可能為環(huán)境污染。 環(huán)境污染中常見的污染源主要有： 1.模板提取時(shí)真空抽干裝置； 2.凝膠電泳加樣器； 3.電泳裝置； 4.紫外分析儀； 5.切膠用刀或手術(shù)刀片； 6.離心機(jī)； 7.冰箱門把手，冷凍架，門把手或?qū)嶒?yàn)臺(tái)面等； 此時(shí)可用擦拭實(shí)驗(yàn)來查找可疑污染源。1）用無菌水浸泡過的滅菌棉簽擦拭可疑污染源；2）；3）取5ml做PCR實(shí)驗(yàn)；4）電泳檢測(cè)結(jié)果。 8.氣溶膠。如果經(jīng)過上述追蹤實(shí)驗(yàn)，仍不能查找到確切污染源，則污染可能是由空氣中PCR 產(chǎn)物的氣溶膠造成的，此時(shí)就應(yīng)該更換實(shí)驗(yàn)場(chǎng)所，若條件不允許，則重新設(shè)計(jì)新的引物（與原引物無相關(guān)性）。 三．污染處理 （一）環(huán)境污染 1.稀酸處理法：對(duì)可疑器具用1mol/L鹽酸擦拭或浸泡，使殘余DNA脫嘌呤； 2.紫外照射（UV）法：紫外波長(zhǎng)（nm）一般選擇254/300nm，照射30min即可。需要注意的是，選擇
外語相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1