ung酶在pcr中的作用(編輯修改稿)
2025-07-22 23:45 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 污染的問題。 一． 污染的預防進行PCR 操作時，操作人員應該嚴格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作，但無論是否能夠達到單人單管，均要求實驗操作在三個不同的區(qū)域內(nèi)進行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進行：1. 標本處理區(qū)，包括擴增摸板的制備；2. PCR 擴增區(qū)，包括反應液的配制和PCR 擴增；3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增? 產(chǎn)物分析? 產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR 擴增所需要的試劑均應在裝有紫外燈的超凈工作臺或負壓工作臺配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來吸取擴增后的DNA 和其他來源的DNA：1．PCR 用水應為高壓的雙蒸水；2．引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無PCR 擴增產(chǎn)物區(qū)配制；3．引物和dNTP 應分裝儲存，分裝時應標明時間，以備發(fā)生污染時查找原因。(三) 實驗操作注意事項盡管擴增序列的殘留污染大部分是假陽性反應的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進行擴增反應是謹慎認真，在樣品的收集、抽提和擴增的所有環(huán)節(jié)都應該注意：1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3. 避免反應液飛濺，打開反應管時為避免此種情況，開蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度；5. 最后加入反應模板，加入后蓋緊反應管；6. 操作時設立陰陽性對照和空白對照，即可驗證PCR 反應的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性；7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標本DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過程中加樣器應該專用，不能交叉使用，尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個區(qū)；8. 重復實驗，驗證結(jié)果，慎下結(jié)論。 二． 追蹤污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設立陰陽性對照：有利于監(jiān)測反應體系各成分的污染情況。選擇陽性對照時，應選擇擴增弱，且重復性好的樣 品，因強陽性對照可產(chǎn)生大量不必要的擴增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對照，100 個拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽性擴增。陰性對照的選擇亦要慎重，因為PCR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點雜交等）檢測陰性的標本中檢測出極微量的靶分子。此外，每次擴增均應包括PCR 體系中各試劑的時機對照，即包括PCR 反應所需的全部成分，而不加模板DNA，這對監(jiān)測試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴增結(jié)果中試劑對照為陽性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時，要全部更換一批新的試劑進行擴增，擴增時設立不同的 反應管，每一管含有一種被檢測試劑，在檢出污染試劑后，應馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可
環(huán)評公示相關推薦
鄂ICP備17016276號-1