ung酶在pcr中的作用(編輯修改稿)
2025-07-22 23:45 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 污染的問(wèn)題。 一． 污染的預(yù)防進(jìn)行PCR 操作時(shí)，操作人員應(yīng)該嚴(yán)格遵守一些操作規(guī)程，最大程度地降低可能出現(xiàn)的PCR 污染或杜絕污染的出現(xiàn)。（一）劃分操作區(qū)：目前，普通PCR 尚不能做到單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作，但無(wú)論是否能夠達(dá)到單人單管，均要求實(shí)驗(yàn)操作在三個(gè)不同的區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，PCR 的前處理和后處理要在不同的隔離區(qū)內(nèi)進(jìn)行：1. 標(biāo)本處理區(qū)，包括擴(kuò)增摸板的制備；2. PCR 擴(kuò)增區(qū)，包括反應(yīng)液的配制和PCR 擴(kuò)增；3. 產(chǎn)物分析區(qū)，凝膠電泳分析，產(chǎn)物拍照及重組克隆的制備。各工作區(qū)要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標(biāo)本制備→PCR擴(kuò)增? 產(chǎn)物分析? 產(chǎn)物處理。切記：產(chǎn)物分析區(qū)的產(chǎn)物及器材不要拿到其他兩個(gè)工作區(qū)。（二）分裝試劑：PCR 擴(kuò)增所需要的試劑均應(yīng)在裝有紫外燈的超凈工作臺(tái)或負(fù)壓工作臺(tái)配制和分裝。所有的加樣器和吸頭需固定放于其中，不能用來(lái)吸取擴(kuò)增后的DNA 和其他來(lái)源的DNA：1．PCR 用水應(yīng)為高壓的雙蒸水；2．引物和dNTP 用高壓的雙蒸水在無(wú)PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物區(qū)配制；3．引物和dNTP 應(yīng)分裝儲(chǔ)存，分裝時(shí)應(yīng)標(biāo)明時(shí)間，以備發(fā)生污染時(shí)查找原因。(三) 實(shí)驗(yàn)操作注意事項(xiàng)盡管擴(kuò)增序列的殘留污染大部分是假陽(yáng)性反應(yīng)的原因，樣品間的交叉污染也是原因之一。因此，不僅要在進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)是謹(jǐn)慎認(rèn)真，在樣品的收集、抽提和擴(kuò)增的所有環(huán)節(jié)都應(yīng)該注意：1. 戴一次性手套，若不小心濺上反應(yīng)液，立即更換手套；2. 使用一次性吸頭，嚴(yán)禁與PCR 產(chǎn)物分析室的吸頭混用，吸頭不要長(zhǎng)時(shí)間暴露于空氣中，避免氣溶膠的污染；3. 避免反應(yīng)液飛濺，打開(kāi)反應(yīng)管時(shí)為避免此種情況，開(kāi)蓋前稍離心收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應(yīng)立刻更換手套并用稀酸擦拭桌面；4. 操作多份樣品時(shí)，制備反應(yīng)混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然后分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應(yīng)的精確度；5. 最后加入反應(yīng)模板，加入后蓋緊反應(yīng)管；6. 操作時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照和空白對(duì)照，即可驗(yàn)證PCR 反應(yīng)的可靠性，又可以協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性；7. 盡可能用可替換或可高壓處理的加樣器，由于加樣器最容易受產(chǎn)物氣溶膠或標(biāo)本DNA 的污染，最好使用可替換或高壓處理的加樣器。如沒(méi)有這種特殊的加樣器，至少PCR操作過(guò)程中加樣器應(yīng)該專用，不能交叉使用，尤其是PCR 產(chǎn)物分析所用加樣器不能拿到其它兩個(gè)區(qū)；8. 重復(fù)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果，慎下結(jié)論。 二． 追蹤污染源如果不慎發(fā)生污染情況，應(yīng)從下面幾條出發(fā)，逐一分析，排除污染。（一）設(shè)立陰陽(yáng)性對(duì)照：有利于監(jiān)測(cè)反應(yīng)體系各成分的污染情況。選擇陽(yáng)性對(duì)照時(shí)，應(yīng)選擇擴(kuò)增弱，且重復(fù)性好的樣 品，因強(qiáng)陽(yáng)性對(duì)照可產(chǎn)生大量不必要的擴(kuò)增序列，反而可能成為潛在的污染源。如果以含靶序列的重組質(zhì)粒為對(duì)照，100 個(gè)拷貝之內(nèi)的靶序列就足以產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增。陰性對(duì)照的選擇亦要慎重，因?yàn)镻CR 敏感性極高，可以從其它方法（Sourthern 印跡或點(diǎn)雜交等）檢測(cè)陰性的標(biāo)本中檢測(cè)出極微量的靶分子。此外，每次擴(kuò)增均應(yīng)包括PCR 體系中各試劑的時(shí)機(jī)對(duì)照，即包括PCR 反應(yīng)所需的全部成分，而不加模板DNA，這對(duì)監(jiān)測(cè)試劑中PCR 產(chǎn)物殘留污染是非常有益的。如果擴(kuò)增結(jié)果中試劑對(duì)照為陽(yáng)性結(jié)果，就是某一種或數(shù)種試劑被污染了。此時(shí)，要全部更換一批新的試劑進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增時(shí)設(shè)立不同的 反應(yīng)管，每一管含有一種被檢測(cè)試劑，在檢出污染試劑后，應(yīng)馬上處理。（二）環(huán)境污染：在排除試劑污染的可
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