【文章內(nèi)容簡介】 預凍一定要徹底，否則，干燥過程中一部分冰會融化而產(chǎn)生泡沫或氧化等副作用，或使干燥后不能形成易溶的多孔狀菌塊，而變成不易溶解的干膜狀菌體。預凍的溫度和時間很重要。n 預凍溫度一般應在30℃以下。在0~10℃范圍內(nèi)凍結，所形成的冰晶顆粒較大，易造成細胞損傷。30℃下凍結，冰晶顆粒細小，對細胞損傷小。n ③ 待結冰堅硬后（~1小時），可開始真空干燥。，~ 。，此時也可以略加溫，以加快樣品中水分升華，但需注意不能超過30℃。n 抽真空過程中樣品應始終保持冷凍狀態(tài)。當樣品基本干燥后，樣品溫度上升，加速了樣品殘留水分的蒸發(fā)。少量樣品經(jīng)4小時左右便可以干燥。，一邊抽氣，一邊即可用噴燈熔封安碚管口。然后以高頻電火花檢查各安瓿的真空情況，管內(nèi)呈灰藍色光表示已達真空。檢查時電火花應射向安瓿的上半部，切勿直射樣品。制成的安瓿管可在4℃冰箱或室溫下保藏。 ⑦液氮超低溫保藏法n 這是鑒于有些微生物不宜采用冷凍干燥法，而其它方法又不能長期保藏，根據(jù)液氮保存精子和血液等的啟發(fā)而發(fā)展起來的菌種保藏法。n 幾乎所有微生物及動物細胞等均可采用液氮超低溫保藏。只有少量對低溫損傷敏感的微生物例外。液氮保藏的另一大優(yōu)點是可利用各種培養(yǎng)形式的微生物進行保藏，不論孢子或菌體、液體培養(yǎng)物或固體培養(yǎng)物均可使用該法。n 液氮超低溫保藏技術已被公認為當前最有效的菌種長期保藏技術之一，也是適用范圍最廣的微生物保藏法。但缺點是保藏費用高，僅用于保存經(jīng)濟價值高、容易變異，或其他方法不能長期保存的菌種。n 液氮超低溫保藏過程是將菌種懸浮液封存于圓底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料應能耐受較大溫差驟然變化）內(nèi)，放到150~196℃的液氮罐或液氮冰箱內(nèi)保藏。n 操作過程中一大原則是“慢凍快融”。為了減輕冷凍損傷程度，可采用保護劑。液氮保藏一般選用滲透性強的保護劑，如甘油和二甲亞砜。它們能迅速透過細胞膜，吸住水分子，保護細胞不致大量失水，延遲或逆轉細胞膜成分的變性并使冰點下降。通常將菌種懸浮在10%（V/V）甘油蒸餾水或10%（V/V）二甲亞砜蒸餾水保護劑中。孢子或菌體懸液的濃度大于108個/ml為好。事先，保護劑甘油應在121℃，蒸汽滅菌15分鐘。二甲亞砜應過濾除菌。 ⑧其他冷凍保藏技術(20℃)n （1）普通冷凍保藏技術(20℃)n 將液體培養(yǎng)物或從瓊脂斜面培養(yǎng)物收獲的細胞分接到試管或指管內(nèi)，然后貯藏于20℃的普通冰箱中。也可將菌種培養(yǎng)在小的試管或培養(yǎng)瓶斜面上，待生長適度后，將試管或瓶口用橡膠塞嚴格封好，同上置于冰箱中保存。n 用此方法可以維持若干微生物的活力1—2年。n 應注意的是經(jīng)過一次解凍的菌株培養(yǎng)物不宜再用來保藏。保藏過程中應注意控制保藏溫度，培養(yǎng)瓶或試管應嚴格密封。n 這一方法雖簡便易行，但不適宜多數(shù)微生物的長期保藏。超低溫冷凍保藏技術(60一80℃)n 要求長期保藏的微生物菌種，一般都要求在60℃以下進行保藏。n 在超低溫冷藏柜中保藏菌種的一般方法是：n 1．離心收獲對數(shù)生長中期至后期的微生物細胞；n 2．用新鮮培養(yǎng)基重新懸浮所收獲的細胞；n 3．加入等體積的20％甘油或10％二甲亞砜；n 4．混勻后分裝入冷凍指管或安瓿中，于70℃超低溫冰箱中保藏。n 如果待保藏菌種生長在斜面上，則可用含10％甘油的新配制液體培養(yǎng)基洗滌收獲。超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在12℃／min。若干細菌和真菌菌種可通過此保藏方法保藏5年而活力不受影響。 ⑨基因工程菌的保藏n 由載體質(zhì)粒等攜帶的外源DNA片段通常是遺傳不穩(wěn)定的、且很易丟失其外源質(zhì)粒復制子。n 質(zhì)?；蛲ǔ樗拗骷毎L非必需，且一般情況下當細胞丟失這些質(zhì)粒時，生長速度會加快。n 當培養(yǎng)基中加入抗生素時，抗生素提供了一個有利于攜帶質(zhì)粒的細胞群體的極為有用的生長選擇壓力。而且抗生素的加入可幫助維持質(zhì)粒復制與染色體復制的協(xié)調(diào)。n 所以建議基因工程菌應保藏在含低濃度選擇劑的培養(yǎng)基中。接種量的概念？ 移入種子的體積接種量＝ ————————— 接種后培養(yǎng)液的體積發(fā)酵級數(shù)及特點？種子罐級數(shù)n 一般由菌絲體培養(yǎng)開始計算發(fā)酵級數(shù)，但有時，工廠從第一級種子罐開始計算發(fā)酵級數(shù)；n 種子罐級數(shù)越少，越有利于簡化工藝，便于控制，減少染菌；減少消毒及值班工作量，減少因種子罐生長異常而造成的發(fā)酵波動。n 級數(shù)大，難控制、易染菌、易變異，管理困難，一般24級。n 接種方式： 一級種子罐：火圈保護接種法和壓差法 ；二級種子罐：壓差法 ；發(fā)酵級數(shù)的確定n ①種子的性質(zhì)（如菌種傳代后的穩(wěn)定性）；②孢子瓶中孢子的密度（密度大則級數(shù)少）；③孢子發(fā)芽及菌絲繁殖速度（生長特性）；④發(fā)酵罐中種子的最低接種量；⑤種子罐與發(fā)酵罐的容積比（發(fā)酵規(guī)模）；q 其中菌種的發(fā)生長特性影響最大q 放線菌（生產(chǎn)抗生素）三級放大，（其中鏈霉素須四級擴大）；n 細菌生長較快，用二級放大培養(yǎng)（斜面菌種→一級種子搖床培養(yǎng)→二級種子罐培養(yǎng)→發(fā)酵罐）。n 還要隨著工藝條件的改變作適當?shù)恼{(diào)整。擴大培養(yǎng)時接種的時機選擇？什么是種子的擴大培養(yǎng)？種子擴大培養(yǎng)的目的、要求及一般步驟？種子擴大培養(yǎng):種子擴大培養(yǎng)是指將保存在砂土管、冷凍干燥管中處休眠狀態(tài)的生產(chǎn)菌種接入試管斜面活化后，再經(jīng)過扁瓶或搖瓶及種子罐逐級擴大培養(yǎng),最終獲得一定數(shù)量和質(zhì)量的純種的過程。這些純種培養(yǎng)物稱為種子。步驟：休眠孢子→母斜面活化→搖瓶種子或茄子瓶斜面或固體培養(yǎng)基孢子→一級種子罐→二級種子罐→發(fā)酵罐種子擴培的目的：接種量的需要，菌種的馴化，縮短發(fā)酵時間、保證生產(chǎn)水平種子的要求：總量及濃度能滿足要求，生理狀況穩(wěn)定，個體與群體，活力強，移種至發(fā)酵后，能夠迅速生長，無雜菌污染微生物發(fā)酵的種子應具備哪些條件？①菌種細胞的生長活力強，轉種至發(fā)酵罐后能迅速生長，延遲期較短。②菌種生理狀態(tài)穩(wěn)定，如菌體形態(tài)、菌絲生長速率和種子培養(yǎng)液的特性等符合要求；③菌體濃度及總量能滿足大容量發(fā)酵罐接種量的要求，一般接種量大，發(fā)酵時間較短；④無雜菌污染，保證純種發(fā)酵；⑤菌種經(jīng)馴化后適應性更強，能保持穩(wěn)定的生產(chǎn)能力。導致菌種衰退的原因有哪些？變異衰退； 分離現(xiàn)象； 自然衰老第五章 培養(yǎng)基的制備培養(yǎng)基及其分類和組成？微生物的培養(yǎng)基根據(jù)生產(chǎn)用途主要分為哪幾類？①天然培養(yǎng)基：是采用化學成分還不清楚或還不恒定的各種植物和動物組織或微生物的浸出物、水解液等物質(zhì)(例如牛肉膏、酵母膏、麥芽汁、蛋白胨等)制成的。適合于除自養(yǎng)菌外各類微生物生長。②合成培養(yǎng)基：用化學成分和數(shù)量完全了解的物質(zhì)配制而成的。成分精確，重復性強，可以減少不能控制的因素；但由于培養(yǎng)基營養(yǎng)單一，一般微生物在合成培養(yǎng)基上生長較慢，有些微生物營養(yǎng)要求復雜，在合成培養(yǎng)基上不能生長， 且價格較高。 適于在實驗室范圍作有關營養(yǎng)、代謝、分類鑒定、生物測定及選育菌種、遺傳分析等定量研究工作。③半合成培養(yǎng)基：多數(shù)培養(yǎng)基配制是采用一部分天然有機物作碳源、氮源和生長因子的來源，再適當加入一些化學藥品以補充無機鹽成分，使其更能充分滿足微生物對營養(yǎng)的需要。大多數(shù)微生物都能在此培養(yǎng)基上生長繁殖。因此，在微生物工業(yè)生產(chǎn)上和試驗研究中被廣泛使用。工業(yè)發(fā)酵中培養(yǎng)基往往依據(jù)生產(chǎn)流程和作用分為：斜面培養(yǎng)基；種子培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)基的特點和要求是什么？（培養(yǎng)基設計）①提供必要的營養(yǎng)成分：培養(yǎng)基成分必須滿足細胞生長，代謝活動和合成產(chǎn)物所需的基本要求；還要注意原料價格低廉，質(zhì)量穩(wěn)定，取材容易。而