【文章內(nèi)容簡介】 傷關(guān)系密切 [16]。如果自由基的產(chǎn)生和清除失衡，就會對機體造成損傷，導(dǎo)致疾病。大量研究表明多糖具有抗氧化性，但是對于多糖抗氧化性的機理現(xiàn)在才剛剛起步，有些機理還不甚明確，人們認為多糖的抗氧化性機理可能與以下幾種情況有關(guān)：（1）多糖分子間接作用與自由基本身。具體又可以分為兩種：①多糖直接作用于抗氧化酶。通過提高體內(nèi)原有抗氧化酶如：SOD，CAT，GSH2Px 等的活性，間接發(fā)揮抗氧化作用。②多糖分子絡(luò)合產(chǎn)生活性氧所必需的金屬離子。多糖結(jié)構(gòu)中的醇羥基可以與產(chǎn)生?OH等自由基所必需的金屬離子（如 Fe2+，Cu 2+等）絡(luò)合，使羥基自由基的產(chǎn)生受到抑制，進而影響脂質(zhì)過氧化的啟動，最終抑制活性氧的產(chǎn)生 [17]（2）多糖分子直接作用于自由基本身。對于脂質(zhì)過氧化而言，多糖分子可以直接捕獲脂質(zhì)過氧化鏈式反應(yīng)中產(chǎn)生的活性氧，阻斷或減緩脂質(zhì)過氧化的進行；對于?OH 而言，多糖碳氫鏈上的氫原子可以與其結(jié)合成水，達到清除?OH 的目的，而多糖的碳原子則因此成為碳自由基，并進一步氧化形成過氧自由基，最后分解成對機體無害的產(chǎn)物；對于超氧陰離子自由基而言，多糖可與其發(fā)生氧化反應(yīng)，達到清除的目的 [18]。 清除羥基自由基活性分析方法 目前國內(nèi)外對有關(guān)?OH 的分析測定方法有許多報道，關(guān)于 ?OH 的分析一般是通過一定的體系產(chǎn)生?OH，再用一些方法來測定反應(yīng)產(chǎn)生的 ?OH，產(chǎn)生?OH的體系有 Fe3+—EDTA—抗壞血酸—H 2O2 體系，F(xiàn)e 2+—EDTA—H2O2 體系，抗壞血酸—Cu 2+—H2O2 體系和黃嘌呤 —黃嘌呤氧化酶— H2O2 體系及紫外光照 H2O2光解產(chǎn)生?OH 等 [18~23]。測定?OH 的方法主要有電子自旋共振法，高效液相色譜法，化學(xué)發(fā)光法，熒光分析法和分光光度法 [33]。電子自旋共振法和高效液相色譜法測定?OH ，雖然靈敏度較高，但是所需儀器昂貴，操作也比較復(fù)雜，一般實驗室難以應(yīng)用。化學(xué)發(fā)光法操作簡便，不需要昂貴的儀器，測定快速。曾有人 [24]用化學(xué)發(fā)光法測定抗壞血酸—Cu 2+—H2O2 體系產(chǎn)生的?OH 。熒光分析法靈敏度同樣很高而且儀器也較化學(xué)發(fā)光法普及，徐向榮等 [25]采用 Ce3+熒光分析法測定 Fenton 反應(yīng)產(chǎn)生的?OH，該法簡便實用，測定快速。與以上方法相比應(yīng)用最廣泛最普及的還是分光光度法，李平等 [26]利用分光光度法檢測各種自由基清除劑對 Fe2+—EDTA—H2O2 體系產(chǎn)生的?OH 的清除作用。其原理是 Fenton 反應(yīng)是經(jīng)典的產(chǎn)生?OH 的體系，可認為能模擬人體內(nèi)產(chǎn)生?OH 的過程，該反應(yīng)是以雙氧水為氧化劑，在亞鐵鹽作用下的氧化反應(yīng)：Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + ?OH + OH—反應(yīng)產(chǎn)生的羥基可以氧化番紅使其褪色，利用分光光度法檢測吸光度變化間接測定所產(chǎn)生的羥自由基。在加入 H2O2 前加入羥基自由基清除劑，F(xiàn)enton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除，體系在 520nm 波長處的吸光度降低程度相應(yīng)減少，采用固定反應(yīng)時間法，在 520nm 波長處測量被測物反應(yīng)液的吸光度并與空白液比較，從而測定被測物對?OH 的清除作用。用番紅與羥自由基反應(yīng)的光度測定法，李平等利用分光光度法測定過山茱萸多糖清除羥自由基的能力，但是由于反應(yīng)體系中 H2O2 含量過高，使實驗結(jié)果誤差很大，為此我們通過試驗對該方法進行了改進，確定了最佳反應(yīng)條件。 清除超氧陰離子自由基活性分析方法對于超氧陰離子自由基（O 2?—）分析測定方法與?OH 的分析方法相似，一般也是通過產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O 2?—）的體系產(chǎn)生 O2?—，然后再通過各種方法測定 O2?—，產(chǎn)生超氧陰離子自由基（O 2?—）的體系有黃嘌呤—黃嘌呤氧化酶—堿性 DMSO，甲硫酸非那宗—NADPH [27，28] 和鄰苯三酚自氧化法 [29，30] 。測定?OH 的方法同樣適用于測定 O2?—，另外還有脈沖輻射法、比色法、單掃描極譜法 [31]、氧電極法 [32]等一些間接測定方法。由于實驗方法需要儀器設(shè)備或條件特殊，一般難以滿足，所以測定 O2?—最常用的方法還是分光光度法。一般是利用分光光度法檢測鄰苯三酚自氧化產(chǎn)物從而間接測定反應(yīng)產(chǎn)生的 O2?—，進而研究 O2?—清除劑的清除 O2?—能力。其反應(yīng)原理是：利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)，測定加入自由基清除劑對產(chǎn)生的 O2?—清除作用。鄰苯三酚在弱堿性（TrisHClEDTA 緩沖液 PH=⒏2）環(huán)境中自氧化分解產(chǎn)生 O2?—的反應(yīng) 鄰苯三酚 O2?— + 其他產(chǎn)物隨著反應(yīng)的進行，O 2?—在體系中不斷積累，致使反應(yīng)液在320nm，325nm，440nm 波長的吸光度在反應(yīng)開始一段時間內(nèi)隨時間變化而線性增長，通過測定鄰苯三酚自氧化系統(tǒng)的吸收光譜，確定自氧化速率最大值及最大吸收波長為 325nm[29]，在此條件下，測定加入自由基清除劑反應(yīng)的吸收光譜確定自氧化速率，各系統(tǒng)的自氧化速率為 S，清除率為 E。另外人們模擬人體黃嘌呤與黃嘌呤氧化酶產(chǎn)生 O2?—的原理研制出了抗超氧陰離子自由基試劑盒，應(yīng)用起來更方便。2 實驗部分 材料與試劑香菇（新鮮市售），東北黑木耳（干，市售），裙帶菜（干，市售），真姬菇（市售），真姬菇純化多糖（ZJ2），番紅為生化試劑，乙醇，丙酮，鄰苯三酚，L—抗壞血酸（Vc ），雙氧水，三羥甲基胺基甲烷，磷酸鹽， EDTANaFe（ Ⅱ）等試劑均為國產(chǎn)分析純。 儀器設(shè)備UV—4802 型紫外可見分光光度計，尤尼柯（上海）儀器有限公司）；SK3200H 超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；ZHT 型自動恒溫電熱套，山東鄄城永興儀器廠；WC/0905 超級恒溫箱；恒溫水浴鍋；FC204 電子天平等 實驗方法 粗多糖的制備稱取干燥的真姬菇 10g 粉碎，研磨，置于燒杯中加 40 倍的蒸餾水，混勻，超聲波 15min 后于 90℃恒溫水浴鍋中攪拌浸提 3h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，殘渣以同樣的方法提取，合并兩次提取液，濃縮至原來體積的三分之一，將濃縮液加到三倍體積的無水乙醇中醇沉 24 小時，減壓抽濾，沉淀物依次用95%乙醇，丙酮洗滌，60℃烘箱干燥，即得到真姬菇粗多糖。將新鮮香菇撕碎烘干，稱取 9g，粉碎，置于燒杯中加入 20 倍體積的蒸餾水混勻，在 80℃恒溫水浴鍋中攪拌浸取 5h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，濃縮至原來體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃烘箱中干燥稱重，得香菇粗多糖。稱取干木耳 10g，粉碎，置于燒杯中加 60 倍體積的蒸餾水，混勻在 80℃水浴鍋中攪拌浸取 4h，減壓抽濾，提取液置于燒杯中，濃縮至原體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃烘箱中干燥稱重，得木耳粗多糖。稱取裙帶菜 10g，粉碎，置于燒杯中加 20 倍體積的蒸餾水煎煮 1h，共煎煮三次，合并濾液，置于燒杯中，提取液置于燒杯中，濃縮至原體積的三分之一，將濃縮液加入三倍體積的無水乙醇醇沉 24h，減壓抽濾，用無水乙醇洗滌，將沉淀于 60℃烘箱中干燥稱重，得裙帶菜粗多糖。 清除羥基自由基（?OH）活性分析方法Fenton 反應(yīng)是經(jīng)典的產(chǎn)生?OH 的體系，可認為能模擬人體內(nèi)產(chǎn)生?OH 的過程，該反應(yīng)是以雙氧水為氧化劑，在亞鐵鹽作用下的氧化反應(yīng)：Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + ?OH + OH—反應(yīng)產(chǎn)生的羥基可以氧化番紅使其褪色，利用分光光度法檢測吸光度變化間接測定所產(chǎn)生的羥自由基。在加入 H2O2 前加入羥基自由基清除劑，F(xiàn)enton 反應(yīng)產(chǎn)生的羥自由基被清除或部分清除，體系在 520nm 波長處的吸光度降低程度相應(yīng)減少，采用固定反應(yīng)時間法，在 520nm 波長處測量被測物反應(yīng)液的吸光度并與空白液比較，從而測定被測物對?OH 的清除作用。反應(yīng)體系（1）中加入 PH=⒎4 的磷酸緩沖液⒉0ml，番紅（520μg/ml） l ，EDTANaFe（Ⅱ）（ ∕L），再加入不同濃度的樣品溶液，%的 H2O2 ，用蒸餾水定容至 10ml，混勻后于 37℃水浴中保溫30min，在 520nm 波長處測吸光度 A 值。反應(yīng)體系（2）中加入 PH=⒎4 的磷酸緩沖液⒉0ml，番紅（520μg/ml） l ，EDTANaFe（Ⅱ）（∕L ），再加入不同濃度的樣品溶液 ，%的 H2O2 ，用蒸餾水定容至 10ml，振蕩搖勻后于 37℃水浴中保溫 30min，在 520nm 波長處測吸光度 A值。以上兩體系測定時，每個試樣做三次平行測定，取其平均值?？瞻捉M以等體積的重蒸水代替樣品溶液，對照組以等體積的重蒸水代替樣品溶液和 EDTANaFe（ Ⅱ）溶液，實驗結(jié)果以清除率 E 表示： 10%???空 白 吸 光 度 值對 照 組 吸 光 度 值 空 白 吸 光 度 值樣 品 組 吸 光 度 值EEc50 表示清除率為 50%時的樣品濃度 清除超氧陰離子自由基（O 2?—）活性的分析方法利用鄰苯三酚自氧化反應(yīng)，測定加入自由基清除劑對產(chǎn)生的 O2?—清除作用。鄰苯三酚在弱堿性