【文章內(nèi)容簡介】 然后以O(shè)D為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)作圖，得到一條過原點(diǎn)的直線，稱為標(biāo)準(zhǔn)曲線，它反應(yīng)了OD與組分含量的對(duì)應(yīng)關(guān)系。然后測(cè)定未知有色溶液的OD，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出與被測(cè)溶液濃度相對(duì)應(yīng)的C值。通過計(jì)算可求出被測(cè)溶液組分的含量。如：要測(cè)水解產(chǎn)生的酪氨酸的量，首先用酪氨酸配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。 圖或求出直線斜率K，再進(jìn)行計(jì)算。綜上所述，可以總結(jié)福林酚法測(cè)定蛋白酶活力的方法要點(diǎn)：用分析純的酪氨酸配成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在一定條件下（溫度、PH、時(shí)間）與福林試劑反應(yīng)顯色，再在分光光度計(jì)上測(cè)定光密度OD值。繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。然后，稱取一定量的酶制劑試樣，配成適當(dāng)濃度的溶液，以過量的酪素為底物在一定溫度、PH條件下與上述酶液作用。水解反應(yīng)進(jìn)行一定時(shí)間后，加入三氯醋酸，終止水解反應(yīng)，并使未水解的酪素沉淀，過濾，水解產(chǎn)物就留在濾液中，移取濾液，加入碳酸鈉中和過量的三氯醋酸，調(diào)節(jié)PH為堿性，加入福林試劑，顯色后在分光光度計(jì)上測(cè)出光密度OD與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算出被測(cè)酶制劑的活力。 三、試劑 本次實(shí)驗(yàn)所用試劑較多，對(duì)于主要試劑重點(diǎn)掌握其配制方法和作用。 1．福林試劑——顯色劑——一種雜多酸兩個(gè)或兩個(gè)以上的酸酐組成的酸叫多酸。含有相同酸酐的多酸叫同多酸。如：H2Cr2O7 → H2O2CrO3而多酸中含有不相同的酸酐時(shí)稱為雜多酸。如：磷鉬酸 H3[P（Mo3O10）4]、磷鎢酸 H3[P（W3O10）4]福林試劑就是雜多酸磷鎢酸和磷鉬酸的混合物，是磷酸作為原酸，PO43中的O2完全被作為配位酸根的Mo3O102 和W3O102所取代，形成了以原酸PO43的成酸原子P為中心原子，其它酸根Mo3O10 W3O102作為配位體的配位酸磷鉬酸、磷鎢酸。一種絡(luò)合物。 雜多酸的制備只需將相應(yīng)的組分在酸性條件下混合并給以一定的條件，如加熱、煮沸等。福林試劑的制備，就是制備雜多酸的過程。MoO42 、WO42離子在PH降低到酸性范圍，則易形成多酸根離子Mo3O10 W3O102。 Na2Wo42H2O 100g Na2MoO42H2o 25g 回流 Li2O4 50gH2O 100ml ———→10hr + H2O 50ml → 混勻 + 溴水—→15` 85﹪H3PO4 50ml Δ Δ 濃HCL 100ml →冷卻→黃色→ 過濾→金黃色濾液入棕色試劑瓶。用時(shí)按1∶2稀釋。可長期保存。雜多酸只有在酸性條件下才是穩(wěn)定的，在堿性條件下雜多酸中的配位酸根很容易被還原成各自元素的還原產(chǎn)物而呈現(xiàn)不同的顏色。如：福林試劑與酪氨酸成鉬藍(lán)和鎢藍(lán)。HO— —CH2—CH—COOH所含的酚羥基具有還原性，可在堿性條件下將福林 ∣還原性 NH2試劑還原。加入Br2將福林試劑中的還原性物質(zhì)氧化得很干凈。2．10﹪三氯醋酸 CL3CCOOH 水溶液，調(diào)節(jié)PH，終止酶促反應(yīng)；3．。 中和過量的三氯醋酸，調(diào)PH為堿性利于顯色； 4．緩沖溶液 維持酶催反應(yīng)的在最適PH下進(jìn)行。測(cè)定不同種類的酶，則選用不同體系的緩沖溶液。以提供最適PH。 如：測(cè)定537酸性蛋白酶選用PH= 檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖溶液 PH=A液：。 C6H8O7H2O → 1000ml CH2—COOH HO—C —COOH CH2—COOHB液：。2H2O→ 1000ml用時(shí)，A∶B=∶。弱酸—弱酸鹽緩沖體系 PH=Pka1lg（C酸/C鹽） = lg（C酸/C鹽） 檸檬酸Pka1= Pka2 = Pka3 = 如測(cè)2709蛋白酶，最適PH=9～11，則選用硼砂—?dú)溲趸{緩沖溶液(PH=10)。 A液：8 H2O 。19g → 1000ml水溶液 B液： mol/L NaOH。 8g → 1000ml水溶液使用時(shí)取A液50ml B液43ml + H2O → 200mlNa2B4O7 + 7H2O === NaOH + 4H3BO3H3BO3 + H2O === B(OH)4 + H+ 一元弱酸Ka=1010 弱酸—弱酸鹽緩沖體系 PH = PKa lg（C酸/C鹽） = lg（C酸/C鹽）A液：。 NaH2PO42H2O → 1000mlB液：。 Na2HPO412H2O → 1000mlA液 28ml+B液 72ml，+ H2O 到1000ml，PH=；A液16ml+B液84ml，+ H2O 到1000ml，PH=。弱酸—弱酸鹽緩沖體系 PH = PKa lg（C酸/C鹽） [H2PO4] = ———— [HPO4=] Ka2 = 108 四、操作手續(xù) (一)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 為了確定光密度OD值與酪氨酸之間量的關(guān)系 1．配制100mg/ml酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 分析純酪氨酸105℃烘干至恒重?！?μg/ml=1000mg/ml(保存在冰箱中)。 移取10ml上述溶液，用 ?！?00μg/ml。 2．系列濃度的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液配制取干燥試管編號(hào)按下表操作。管號(hào)酪氨酸濃度（μg/ml）加100μg/ml酪氨酸的量（ml）加蒸餾水的量（ml）00010110192202833037440465505566064用5或10ml刻度移液管移取由于6號(hào)管濃度較大，顯色后顏色太深，測(cè)量不準(zhǔn)，偏離吸收定律較大，所以往往只做到5號(hào)，～。解釋：（1）為什么酪氨酸要干燥至恒重？在此酪氨酸作為基準(zhǔn)物，所以應(yīng)干燥至恒重，防止含有水份帶來誤差。（2）？為了作圖描點(diǎn)在軸上好表示，故希望系列濃度取整數(shù)，這樣更準(zhǔn)確，減少誤差。（3）為什么酪氨酸用鹽酸溶解？凡有需制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)驗(yàn)，為了減少誤差，總是盡可能的使制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時(shí)的條件與實(shí)際測(cè)定條件一致，消除因條件差異所帶來的誤差，提高測(cè)定準(zhǔn)確度。酪氨酸是兩性物質(zhì)，酸堿均可用溶，而為什么在此用鹽酸不用堿呢？正是考慮上述原因，因?yàn)槊复呋业鞍姿夥磻?yīng)是用 來終止的，酪蛋白水解的酪氨酸是處在酸性介質(zhì)中的，用酸溶解剛好前后介質(zhì)一致。 3．系列濃度的酪氨酸顯色并測(cè)OD值 ，福林試劑1ml，搖勻放入40℃水浴上顯色10分鐘，應(yīng)顯藍(lán)色，冷卻到室溫。用0號(hào)管調(diào)零，1cm的比色皿，680nm波長下測(cè)OD值。 說明： （1）所加各試劑均用刻度移液管移取，保證體積一至。 （2）顯色后需冷卻到室溫，因?yàn)镵值受溫度的影響。 （3）每一個(gè)點(diǎn)均測(cè)兩份平行試樣，誤差ΔOD≤，這樣算來共用36＝18支干試管。 4．描點(diǎn)作圖 （1）畫圖求直線斜率的倒數(shù)K 應(yīng)為一條過原點(diǎn)的直線。各點(diǎn)OD取平均試樣的平均值，為了便于后面計(jì)算。應(yīng)求出 K=ΔC/ΔOD（μg/ml OD） 即OD為一個(gè)單位時(shí)所相當(dāng)?shù)睦野彼釢舛取? （2）計(jì)算求K 根據(jù)各點(diǎn)所測(cè)平均OD 分別求出K=C/OD取K=（K1+K2+K3+K4+K5）/5 （3）直接查取 （4）電腦做圖、計(jì)算、使用 四種方法均可使用，道理都一樣。 標(biāo)準(zhǔn)曲線所用儀器不同，試劑不同或其它條件的不同均會(huì)引起變動(dòng)。故應(yīng)定期校正。更換儀器、更換試劑。標(biāo)準(zhǔn)曲線應(yīng)重新制作。同樣實(shí)測(cè)應(yīng)與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線條件一致。儀器、試劑、比色皿厚度、操作等。 注意：直線應(yīng)落在一群點(diǎn)的中間，同時(shí)縱橫坐標(biāo)的比例，使直線處于坐標(biāo)系的中間。 （二）測(cè)定蛋白酶活力——實(shí)測(cè) 1．底物配制 測(cè)定酸性蛋白酶（如537）﹪?yán)宜嘏渲? 加入約50mlPH=，然后在沸水中加熱，到清晰透明冷卻后再以上述緩沖溶液定容到100ml，若有泡沫，可加1～2滴無水酒精消除。置于4℃的冰箱中保存，超過5天另外配制。測(cè)定堿性蛋白酶（如2709）或中性蛋白酶（如1398）﹪?yán)宜嘏渲? ，工業(yè)大平即可，(多點(diǎn)少點(diǎn)沒關(guān)系)于小燒杯中，在沸水浴上溶解(透明液體)，冷卻，用精密試紙檢查調(diào)節(jié)PH為測(cè)酶的最適PH,（如PH=10；PH=）然后用相應(yīng)的緩沖溶液定容到100ml，置于4℃的冰箱中保存，超過5天另外配制。 2．配置待測(cè)酶液 `(潮濕為止)，再加數(shù)滴緩沖液再磨5`，加緩沖液攪拌均勻、沉降，轉(zhuǎn)移上層清液。如此反應(yīng)3~4次，到酶液及所有殘?jiān)D(zhuǎn)入容量瓶中，用緩沖溶液定容到200ml。搖勻過濾(8層干沙布)，濾溶液于干燒杯中，吸取濾液10ml，用緩沖溶液定容到100ml容量瓶中。實(shí)測(cè)時(shí)只需吸取二次定容后的酶液1ml 那么實(shí)際用了所稱量酶的幾分之幾呢?(即稀釋倍數(shù)為多少呢)（10/200）（1/100）=1/2000 故稀釋倍數(shù)為2000 用了酶粉W/2000(g) 此次操作關(guān)鍵有兩點(diǎn)：稱量重量與稀釋倍數(shù)、研磨時(shí)間。 （1）稀釋倍數(shù)與稱量重量的原則 177。（~），~。 稱量重量與稀釋倍數(shù)相互聯(lián)系，要么固定稱量，改變稀釋倍數(shù)，來測(cè)OD。 要么固定稀釋倍數(shù)改變稱量重量，以使OD落在范圍內(nèi)。一次測(cè)定時(shí)通常是固定稱量重量。而改變稀釋倍數(shù)，尤其是改變第二次稀釋倍數(shù)。這樣比較方便。多次測(cè)定常采用改變稱量重量，固定稀釋倍數(shù)。 （2）研磨時(shí)間 酶制劑是粗制品，顆粒大小不均。又有雜質(zhì)及不溶物混在一起，尤其是填料能吸附一部分酶體，故需研磨浸提。使酶的活性基團(tuán)充分暴露出來，故研磨浸提程度不同?；鶊F(tuán)暴露程度不同，活力也不同。關(guān)鍵是第一、二次，故用力及時(shí)間應(yīng)力求均衡準(zhǔn)確，最后的殘?jiān)舱俭w積，故需全部轉(zhuǎn)移進(jìn)去定容。 3．測(cè)定 酶催化 酪蛋白 酪氨酸 條件底物酪素液40℃水浴予熱。取9支干試管編號(hào)，按下表順序操作，所用試液均用刻度移液管準(zhǔn)確移取?？瞻坠?平行管1平行管2酶液（ml）11110﹪三氯乙酸（ml）3 00酪素（ml）2 2 2 現(xiàn)象白色↓無無操作40℃水浴保溫10分鐘10﹪三氯乙酸（ml）033現(xiàn)象白色↓白色↓白色↓操作取出搖振后室溫下靜置數(shù)分鐘過濾接濾液1`1`2`干試管0``1``2``移取濾液（ml）111 Na2CO3（ml）555福林試劑（ml）111操作40℃水浴保溫10分鐘 取出冷卻至室溫，用空白對(duì)照管0``調(diào)零，測(cè)1``、2``平行管。 解釋： （1）三個(gè)順列試管0為空白管，2為平行試樣管，即一樣的東西。0號(hào)先加入CCL3COOH 使酶不能催化酪素水解。而2號(hào)管使酶作用底物10`以后再迅速加入CCL3COOH終止反應(yīng)，故0號(hào)一開始就有白色↓，而2管10`后加CCL3COOH后產(chǎn)生白色↓酪素。 （2）為了便于過濾保證濾液透明干凈，應(yīng)使↓沉靜片刻顆粒凝聚變大，濾紙應(yīng)是干燥的。 （3）濾液中所含酪氨酸，即酶催化酪素產(chǎn)生的水解物是處在酸性介質(zhì)中，與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線一致。 （4）為什么不以蒸餾水為空白呢? 在比色分析中，常需利用空白溶液(又稱參比或?qū)φ杖芤?調(diào)節(jié)儀器的消光度為0。以消除顯色溶液中其它有色物質(zhì)的干擾，抵消比色皿和試劑對(duì)入射光的影響。常用的空白有三種：蒸餾水空白、試劑空白和平行操作空白。若所用操作試劑無色，對(duì)測(cè)定沒影響。則可用蒸餾水作空白調(diào)零。而我們這次均用了平行操作空白。即沒有反應(yīng)實(shí)測(cè)的實(shí)測(cè)。以消除溶劑、各種試劑、水、器皿和操作條件帶入的誤差。比如實(shí)測(cè)時(shí)，底物在配制溶液過程中以及以后的操作中，難免產(chǎn)生微量的水解，或多或少卻不可避免。此水解產(chǎn)生的酪氨酸。并非由酶催化而產(chǎn)生，故應(yīng)扣除掉這部分。用平行測(cè)定空白即上述溶液為空白，即可做到這一點(diǎn)，也可消除其它因素帶來的影響。所以，空白也是有顏色的，肉眼看不見的淺藍(lán)色。2號(hào)肉眼所觀的顏色深淺應(yīng)一致，否則肯定不平行。（4）前后兩個(gè)10分鐘有什么不同？前要準(zhǔn)確，后可以多，但不可少。 五、計(jì)算 兩份平行試樣結(jié)果平行后（ΔOD≤）取平均值計(jì)算：1g酶粉或1ml酶液每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生酪氨酸的μg數(shù)。 單位/g =（KOD6N）/（10W）=（6KODN）/（10W） OD：實(shí)測(cè)水解底物時(shí)所產(chǎn)生酪氨酸的光密度 K：當(dāng)OD值為1單位時(shí)所