【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 小管：分別計(jì)數(shù)皮、髓質(zhì)各50個(gè)腎小管，分別乘以2再求其百分?jǐn)?shù)?！臼炃衅庖呓M化】1．標(biāo)本處理(1)標(biāo)本固定(升汞一苦味酸固定液)A液：飽和氯化汞4．5ml甲醛0．5ml(臨用時(shí)混合)B液：苦味酸飽和溶液組織取好后，先放入A液中5min，再將組織轉(zhuǎn)入B液2．5ml中5h至過夜。(2)脫水①75％乙醇10min洗苦味酸。②90％伊紅乙醇10～15min。③95％乙醇10～15min。④將組織塊用擦鏡紙包好，放人無(wú)水乙醇(優(yōu)級(jí)醇)10min2，中間搖動(dòng)數(shù)次。(3)透明：將組織塊放入氯仿中10min2，10min后更換氯仿。(4)浸蠟：將透明過的組織投入蠟工(60℃，不含松香)20～30min，再移至蠟Ⅱ(60℃，含少許松香)1～1．5h。(5)包埋、切片：將浸過蠟的組織包埋成蠟塊，切片時(shí)將蠟塊凍人液氮罐中l(wèi)min，取出切片lμm厚，蠟片漂浮于35℃水中，貼片后62℃烤片5min，冷卻待用。2．石蠟切片PAP四層法染色(1)將石蠟切片脫蠟入水，先人二甲苯工、Ⅱ缸，各10min，再入無(wú)水乙醇、95％乙醇、75％乙醇各10min，將切片浸入水中。(2)如需要0．05％胰蛋白酶消化5min，水洗。(3)PBS洗片。(4)10％FCS室溫20min。(5)加工作濃度的特異性單克隆抗體室溫過夜。(6)余后處理完全同冰凍切片染色法。四、腎活檢標(biāo)本電子顯微鏡超薄切片的制備技術(shù)電子顯微鏡觀察腎穿刺組織超微結(jié)構(gòu)是腎臟疾病診斷及科研工作的重要內(nèi)容之一。電鏡觀察的成功與否與標(biāo)本制備的質(zhì)量密切相關(guān)，因此，必須十分重視電鏡標(biāo)本制備技術(shù)。超薄切片是電鏡工作中重要的一環(huán)，包括取材、固定、脫水、浸透和包埋、切片、染色等步驟，現(xiàn)將超薄切片的步驟和要求分述如下。【取材】1．要求 取材必須強(qiáng)調(diào)快、小、準(zhǔn)、低溫操作、避免拉傷。(1)快：所取材料力求保持在生活狀態(tài)中，因此，應(yīng)爭(zhēng)取在穿刺組織取出后半分鐘內(nèi)固定。(2)?。弘婄R固定液對(duì)組織的穿透能力較弱，故組織塊大小以不超過1 mm3為宜。(3)準(zhǔn)：電鏡觀察有一定的局限性，若標(biāo)本中無(wú)腎小球則難以提供診斷意見，因此應(yīng)注意取材準(zhǔn)確性。合格的電鏡標(biāo)本中應(yīng)含有1個(gè)以上的腎小球。(4)低溫操作：血供停止后，組織和細(xì)胞內(nèi)各種酶的活動(dòng)迅速造成組織自溶。為了避免這種現(xiàn)象，需在0～4℃操作，夏季最好將組織放在冰塊上操作，所用器械應(yīng)先預(yù)冷。(5)避免拉傷：組織被牽拉和擠壓將直接影響觀察效果，所以，取材應(yīng)選用鋒利的器械，操作時(shí)切勿牽拉或擠壓組織。2．步驟 將蠟板置冰塊中，滴上冷(4℃)的電鏡固定液，將腎活檢組織迅速放人蠟板上的固定液中，并用鋒利的刀片切成Imm3的小塊，然后移入清潔的小瓶中，確保組織塊全部浸沒在固定液中，加蓋，4℃下固定。【固定】固定的目的是為了在分子水平上保存生物細(xì)胞的每一細(xì)節(jié)，使其最大限度地接近生活狀態(tài)，盡量減少“死后變化”，以利于電鏡下的觀察、判斷。1．固定方式 分物理和化學(xué)固定兩種方式，生物組織和細(xì)胞的固定多選用化學(xué)方法。即一定的化學(xué)試劑和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)發(fā)生化學(xué)結(jié)合形成交聯(lián)，穩(wěn)定蛋白質(zhì)，并保存脂肪、糖類、借此來固定細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使它們處于生活狀態(tài)時(shí)的位置。2．固定劑的選擇 理想的固定劑應(yīng)具備：能迅速、均勻地滲入到組織內(nèi)部；較好地穩(wěn)定各種結(jié)構(gòu)成分；保存一定的酶活力；不使細(xì)胞收縮或膨脹；沒有人工假象，以保證電鏡圖像的真實(shí)性。此外，固定劑的pH、滲透壓及電解質(zhì)也與其固定效果有直接的關(guān)系。3．常用的固定劑 (1)戊二醛(glutaraldehyde C5H8O2) 用它固定的組織結(jié)構(gòu)細(xì)膩，成分喪失少。其結(jié)構(gòu)式為O—CH—CH2：一CH2一CH2一CH—O，一般配成3．75％的溶液(pH7．2～7．4)置4℃冰箱中備用，標(biāo)本固定時(shí)間為4℃2h。①戊二醛固定液的配制方法0．2mol／L磷酸緩沖液A液 Na2P042H2 O 35．61g雙蒸水加至1 000mlB液 NaH2P04H20 27．6g雙蒸水加至1 000ml0．2 mol／L磷酸緩沖液25℃ pH A液 B液7．2 36．0ml 14．0ml7．3 38．5ml 11．5ml7．4 40．5ml 19．5ml戊二醛固定液3．75％(戊二醛+雙蒸水)：磷酸緩沖液一1：1(15ml+35m1)：50ml===1．1戊二醛加入后pH略有下降②戊二醛的主要優(yōu)點(diǎn)：對(duì)組織的穿透力較強(qiáng)、較快；與細(xì)胞有很強(qiáng)的親和力，對(duì)糖原、核蛋白，尤其是微管、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞膜基質(zhì)都有較好的固定作用；能保存某些酶活性，適于進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究；組織塊在其冷溶液中可以保存數(shù)周至數(shù)月而微細(xì)結(jié)構(gòu)不發(fā)生改變。③戊二醛的缺點(diǎn)：沒有“電子染色”的作用，經(jīng)它單獨(dú)固定的標(biāo)本反差很弱；對(duì)脂質(zhì)作用很差，脫水后大部分脂質(zhì)會(huì)被抽?。徊挥绊懠?xì)胞滲透壓，故對(duì)緩沖液滲透壓要求很高。(2)鋨酸(osmium tetroxide 0sO4)鋨酸又稱四氧化鋨。它是一種淡黃色結(jié)晶體，水溶液是中性，具有很強(qiáng)的揮發(fā)性和毒性。鋨酸是貴重、優(yōu)良的電鏡標(biāo)本固定劑。一般用它作后固定。固定時(shí)間因組織不同而異，一般1～2h／4℃。①鋨酸固定液的配制：將市售淡黃色結(jié)晶狀的鋨酸安瓿(0．5g，1．0g兩種)洗凈，放入清洗干凈的棕色磨口瓶?jī)?nèi)，蓋緊瓶塞，振破安瓿，放入一定量蒸餾水，配成2％水溶液(鋨酸1g加人500ml蒸餾水)，置2d后待其完全溶解成無(wú)色透明或淡黃色清液方可使用。臨用時(shí)取此液加等量的O．2mol pH7．4的緩沖液，使成1％溶液。②鋨酸的主要優(yōu)點(diǎn)：是一種強(qiáng)氧化劑，對(duì)氨具有很強(qiáng)的親和力，幾乎能和所有細(xì)胞成分結(jié)合，較完好地保存細(xì)胞微細(xì)結(jié)構(gòu)；能與不飽和脂肪酸結(jié)合，形成脂肪一鋨酸復(fù)合物，是唯一能夠固定脂類物質(zhì)的固定劑；較好地保存核蛋白；本身密度高，產(chǎn)生良好的電子反差，彌補(bǔ)戊二醛固定的不足；對(duì)緩沖液要求不嚴(yán)格；在固定時(shí)間合適的情況下，不會(huì)使固定組織變硬變脆及收縮和膨脹，便于以后超薄切片。③鋨酸的缺點(diǎn)：分子較大，滲透力弱，組織塊若超過1mm3，固定效果則差，引起固定不均勻；對(duì)糖原、核酸及微管固定差，不適于進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)工作；標(biāo)本長(zhǎng)時(shí)間停留在固定液中會(huì)使組織變脆，造成切片困難；揮發(fā)性和毒性大，對(duì)人體有害。戊二醛和四氧化鋨各自存在著許多優(yōu)、缺點(diǎn)，共同固定可互補(bǔ)對(duì)方的不足。因此，現(xiàn)在多采用戊二醛作前(預(yù))固定，鋨酸后固定，此即雙固定法。腎穿刺標(biāo)本取材不易，超微結(jié)構(gòu)觀察要求細(xì)致，保存細(xì)胞成分越多越好，一般均選用戊二醛一鋨酸雙固定。固定液用量一般為標(biāo)本的40倍。醛類和鋨酸混合后會(huì)起氧化還原反應(yīng)，形成還原鋨沉淀。因此，標(biāo)本經(jīng)戊二醛作固定后必須充分水洗，并用磷酸緩沖液清洗數(shù)遍。除上述兩種固定液外，還可用4％多聚甲醛及高錳酸鉀作電鏡固定液。4％多聚甲醛經(jīng)濟(jì)、易得，不受條件限制，固定效果較接近戊二醛；高錳酸鉀對(duì)磷脂類固定效果好，適于保存細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)。但腎穿刺組織一般不采用這兩種固定液。4．固定的步驟 常規(guī)使用3．75％冷戊二醛作預(yù)固定，通常在4℃下固定2h或過夜，O．1mol／L的磷酸緩沖液沖洗后1％鋨酸作后固定，一般4℃下固定1．5～2h?！久撍侩婄R包埋材料大多是不溶于水的，為了保證包埋介質(zhì)完全滲入組織內(nèi)部，必須用一種水及滲透液均能相溶的惰性液體來取代水，將組織內(nèi)水分驅(qū)除干凈。一般用一系列濃度的乙醇或丙酮進(jìn)行脫水。脫水液量與組織塊之比大于1：20倍，室溫下操作。為便于包埋劑滲透，在脫水之后包埋之前可加入環(huán)氧丙烷(propylene ox—ide)作中間溶劑；為提高樣品反差，也可在70％乙醇脫水過程中加醋酸鈾進(jìn)行組織塊染。具體步驟：采用丙酮脫水劑，由低濃度開始，逐漸增加濃度，一般由30％、50％、70％、90％、100％逐漸遞增，每級(jí)10～15min，純丙酮脫水45min(每15min換液1次)。脫水應(yīng)充分，否則可造成包埋劑浸透不全、聚合不好等，影響切片質(zhì)量?！窘?、包埋及聚合】包埋劑為液體介質(zhì)，它可以滲入組織取代脫水液，并能在一定溫度下聚合，硬化成固體，有足夠的彈性作為細(xì)胞支架，使細(xì)胞能承受超薄片，耐受電子束轟擊。理想的包埋劑應(yīng)黏度較低，易滲入組織，對(duì)組織不起化學(xué)反應(yīng)，能溶于脫水劑；聚合均勻、充分，不產(chǎn)生體積收縮；軟、硬度適中，容易切片；透明度好，不產(chǎn)生前景反應(yīng)，材料來源豐富，操作簡(jiǎn)便。目前廣泛應(yīng)用的包埋劑是環(huán)氧樹脂Epon812，這是一種熱塑性樹脂，微黃色液體，黏度較低(25℃150～120厘泊)，它和一定量的硬化劑作用后，在一定溫度下形成不可逆交鏈的黃棕色固體。硬化劑一般都用二酸酐類，它起交鏈、固化作用。Epon812的優(yōu)點(diǎn)是能夠保存組織的細(xì)微結(jié)構(gòu)。1．配制包埋劑注意事項(xiàng) ①包埋劑配制要準(zhǔn)確無(wú)誤，尤其是DMP30；②包埋劑攪拌要充分，依次按時(shí)加入；DMP30需緩慢加入，并至少攪拌10min使其充分混合；③加入硬化劑時(shí)勿加溫，以免發(fā)生提早聚合；④操作時(shí)注意防潮，應(yīng)在相對(duì)濕度40％以下的密閉操作箱內(nèi)進(jìn)行，以防造成包埋介質(zhì)渾濁，聚合不勻，硬度和彈性不當(dāng)?shù)取?．浸泡、包埋、聚合過程(1)浸泡：脫水后的標(biāo)本，移人包埋劑與純丙酮l：l中30min以上，再移人2：1中3h，人純包埋劑3h。(2)包埋：取1號(hào)或2號(hào)藥用透明膠囊，內(nèi)放標(biāo)本號(hào)，烤干，注入包埋劑，再放樣品于膠囊中央，樣品會(huì)逐漸下沉到膠囊底部，移人烤箱，37℃12～24h，45℃12h，60℃12～24h聚合。包埋劑多用環(huán)氧樹脂，配法如下：A液：Epon812 62ml B液：Epon812 100mtDDSA 100ml MNA 89ml改變A液和B液的比例則可調(diào)節(jié)聚合塊的硬度，A液多則軟，B液多則硬?？梢暯M織的硬度和氣候不同調(diào)節(jié)其比例。臨用時(shí)取A、B液按下列比例配好后，通常冬天A：B＝3：7或4：6或5：5；春秋A：B＝2：8；夏天A：B＝1：9。試劑名稱：Epon812 環(huán)氧樹脂 812DDSA 十二烷基琥珀酸酐(硬化劑)MNA 甲基內(nèi)次甲基四氫苯二甲酸酐(硬化劑)DMP30 2，4，6一三(二甲氨基甲基)苯酚(加速劑)聚合好的膠囊是微黃(棕)色固體，透明、均勻、無(wú)氣泡；組織塊位于膠囊底端中心?！拘迚K定位及步驟】1．修塊 聚合好的包埋塊，固定在樣品夾中，在解剖顯微鏡下，用銳利的刀片小心地修去頂部及周圍的包埋介質(zhì)，暴露出組織來，再把組織塊四周的包埋介質(zhì)修成四面錐體，組織塊表面要修平整，根據(jù)組織大小修成各種形狀，上下邊緣最好互相平行，如梯形、長(zhǎng)方形或正方形等，大小約lm㎡。可切去一角留作記號(hào)，以方便定位。2．定位 因電鏡僅能觀察某(幾)個(gè)細(xì)胞形態(tài)及內(nèi)部微細(xì)結(jié)構(gòu)，超薄切片亦只能切0．04～0．09m㎡，故準(zhǔn)確定位非常重要。腎穿刺組織定位更是如此。如定不到腎小球則意味著整個(gè)過程失敗。3．步驟 將修好的組織包埋塊在超薄切片機(jī)下切成0．5～1／μm的切片，經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，選取合適的小球及病變部位，修去多余的組織。修時(shí)選用鋒利刀片，邊要直，角要銳，便于超薄切片。甲苯胺藍(lán)染色：半薄切片用O．5％甲苯胺藍(lán)水溶液染色約lmin(可在火焰上加溫，待看到水汽時(shí)停止)，水洗，鏡下定位?！境∏衅? ．切片是樣品制備過程中技術(shù)性較強(qiáng)的一環(huán)，可按如下條件、步驟操作。1．載網(wǎng)與支持膜 超薄切片的載網(wǎng)是具有透明支持膜的銅網(wǎng)，圓形，直徑大多為3mm，網(wǎng)孔一般有50～300目，可有正方形、圓形，亦可有單孔，可根據(jù)試驗(yàn)不同而加以選擇。支持膜一般用Formvar(聚乙烯醇縮甲醛)膜，它具有相當(dāng)好的機(jī)械強(qiáng)度和透明度，若復(fù)以碳膜可更堅(jiān)固。另有火棉及碳膜、微篩膜等，各有其所長(zhǎng)。Formvar膜的制備：制膜濃度可從0．2％～0．5％，做膜前，將新銅網(wǎng)浸入無(wú)水乙醇中清洗，濾干后備用。將干凈玻片插入Formvar液中，立即提起，垂直放置待干，膜干后漂于蒸餾水面，放上銅網(wǎng)，濾紙撈起。2．切片刀 超薄切片需要特殊的切片刀——玻璃刀或鉆石刀。玻璃要求很高，厚5～8 mm，硬度要合適；制作玻璃刀一般用專門的制刀機(jī)，制刀要求干凈，角度合乎標(biāo)準(zhǔn)，刀口銳利等，切片刀的優(yōu)劣直接影響超薄切片。鉆石刀更為優(yōu)良，可切出10～20mm的切片，使用壽命更長(zhǎng)，但價(jià)格昂貴而不常用。3．超薄切片機(jī) 我們使用的是瑞典LKB一Ⅱ型超薄切片機(jī)，它能切出半薄和超薄切片，切片厚度能控制在5～200nm，還可根據(jù)需要自動(dòng)調(diào)節(jié)，切出厚度均勻的連續(xù)切片帶。4．超薄切片術(shù) 超薄切片的質(zhì)量與玻璃刀、架刀角度、收集槽液面、組織塊硬度、組織的固定、脫水、包埋過程以及包埋塊的修整，切片機(jī)性能和操作者的責(zé)任心等因素有密切關(guān)系。操作基本過程為開機(jī)一固定組織塊一架刀一手動(dòng)修塊一注水槽一自動(dòng)連續(xù)切片一收集片一撈片。切片時(shí)尚需有適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸?，?0℃，濕度60％以下為佳。超薄切片比較合適的厚度為40～60nm，切片越薄，分辨率越高，對(duì)比度則越低。切片的厚度由于涉色估計(jì)，其顏色與厚度的關(guān)系如下：干涉色 切片厚度(nm)灰色 50銀白色 50～70金黃色 70～90紫色 90選灰色和銀白色的切片撈于有膜銅網(wǎng)(或鎳網(wǎng))上，一般支持膜厚10～20nm，無(wú)結(jié)構(gòu)，耐電子轟擊，不起化學(xué)反應(yīng)。【染色】透射電鏡標(biāo)本染色是以組織和細(xì)胞染色后對(duì)電子散射的程度來顯示出不同的結(jié)構(gòu)，需用重金屬與組織中某些成分結(jié)合或被吸附來達(dá)到染色目的。目前采用的是醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，以達(dá)到互補(bǔ)作用。1．染色的要求 理想染色劑的標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)是能夠增強(qiáng)反應(yīng)；選擇性地使重金屬常沉淀在一定部位上；保持微細(xì)結(jié)構(gòu)的完整性；不與固定劑發(fā)生不良反應(yīng)；在室溫和正常大氣壓情況下，配制簡(jiǎn)單，操作方便，染色均勻。 (1)醋酸鈾：又稱醋酸雙氧鈾，結(jié)構(gòu)式為UO2(CH3COO)22H20，它可以和大多數(shù)細(xì)胞成分結(jié)合，易與核糖核酸顆粒反應(yīng)，降低組織類脂的提取。pH對(duì)于醋酸鈾結(jié)合到生物各種基質(zhì)上的能力有很大影響，pH＞3．5時(shí)，雙氧鈾離子對(duì)DNA的親和力明顯增加。 (2)