酵母蔗糖酶的提取及其性質研究(編輯修改稿)
2025-06-22 22:00 本頁面
【文章內容簡介】 低時，抑制蛋白質陰離子化，隨之降低了蛋白質對陰離子交換劑的吸附。當使用陰離子交換劑時，增加鹽離子，則降低 pH值。當使用陽離子交換劑時，增加鹽離子濃度，則升高溶液 pH值。 離子交換劑使用前一般要進行處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。而后用水懸浮去除雜質和細小顆粒。再用酸堿分別浸泡，每一種試劑處理后要用水洗至中性，再用另一種試劑處理，最后再用水洗至中性，這是為了進一步去除雜質，并使離子交換劑帶上需要的平衡離子。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為 Na型（即平衡離子是 Na離子），陰離子交換劑為 Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。常用的酸是 HCl，堿是 NaOH或再加一定的 NaCl，這樣處理后陽離子交換劑為 Na型，陰離子交換劑為 Cl型。使用的酸堿濃度一般小于 mol / L，浸泡時間一般 30 min。處理時應注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。 柱上操作 ⑴交換劑裝柱最簡單的交換層析柱可用 堿式滴定管 代替。處理過的樹脂放入燒杯，加少量水邊攪拌邊倒入保持垂直的層析管中，使樹脂緩慢沉降。交換劑在柱內必須分布均勻。 ⑵上樣向層析柱內傾入樣品液 ⑶洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。原則是用一種比吸著物質更活潑的離子，把吸著物交換出來。由于被吸著的物質往往不是我們所要求的單一物質，因此除了正確選擇洗脫液外還采控制流速和分布收集的方法來獲得所需的單一物質。 離子交換柱層析純化蔗糖酶 操作步驟 ： 稱取 DEAE纖維素（ DE23）干粉，加入 NaOH溶液（約 50ml），輕輕攪拌，浸泡至少 （不超過 1小時），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加 50ml M HCl, 攪勻，浸泡 時，同上，用去離子水洗至近中性，再用 M NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。（因 DEAE纖維素昂貴，用后務必回收）。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過回收的，按 “ 堿 → 鹽 ” 的順序洗即可（ M NaOH,1 M NaCl 溶液處理），然后水洗至中性。最后保存在 20%的酒精溶液中。 ： 先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用 mol/L pH TrisHCl 緩沖液洗瓊脂糖凝膠幾次，裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。（一般洗 23個柱體積） ： 上樣前先準備好梯度洗脫液，本實驗采用 30ml TrisHCl緩沖液和 30ml含 1MNaCl的 TrisHCl緩沖液，進行線性梯度洗脫。取兩個相同直徑的 50ml量杯，一個裝 30ml含 NaCl的高離子強度溶液，另一個裝入 30ml低離子強度溶液，放在磁力攪拌器上，在低離子強度溶液的量杯內放入一個小攪拌子，使兩杯溶液形成連通，注意兩個杯要放妥善，切勿使一杯高、一杯低。 用 2ml TrisHCl緩沖液充分溶解醇級分 Ⅲ ，若溶液混濁，則用小試管， 10000rpm離心 除去不溶物。取 （即醇級分 Ⅲ 樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量），將剩余的上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約 20ml緩沖液 洗去柱中未吸附的蛋白質 ，至 A280降到 ，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細塑料導管放入不含 NaCl的低離子強度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余 30ml高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速 。 測定每管洗脫液的 A280光吸收值，合并活性最高的 23管，量出總體積，此即 “ 柱級分 IV”。 注意：從上
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