酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究-全文預覽
【正文】 /mg 純化倍數(shù) 1 回收率 % 100 純化倍數(shù) =該步的比活力 /第一次的比活力 回收率 =該步的總活力 /第一次的總活力 ? 試管用后清洗干凈，放入烘箱 本實驗是以蔗糖為底物，測定蔗糖酶與底物反應的時間進程曲線，即在酶反應的最適條件下，每間隔一定的時間測定產(chǎn)物的生成量，然后以 酶反應時間 為橫座標， 產(chǎn)物生成量 為縱座標，畫出酶反應的時間進程曲線，由該曲線可以看出，曲線的起始部分在某一段時間范圍內(nèi)呈直線，其 斜率 代表酶反應的初速度。這些具有還原性的糖與 堿性銅試劑 混合加熱后被氧化，二價銅被還原成棕紅色氧化亞銅沉淀，氧化亞銅與 磷鉬酸 作用，生成蘭色溶液，其蘭色深度與還原糖的量成正比，于650nm測定光吸收值。各級分先要仔細尋找和試測出合適的稀釋倍數(shù)，并詳細記錄稀釋倍數(shù)的計算（使用移液管和量筒稀釋）。上樣后用緩沖液洗兩次，然后再用約 20ml緩沖液 洗去柱中未吸附的蛋白質(zhì) ，至 A280降到 ，夾住層析柱出口，將恒流泵入口的細塑料導管放入不含 NaCl的低離子強度溶液的小燒杯中，接好層析柱，打開磁力攪拌器，放開層析柱出口，開始梯度洗脫，連續(xù)收集洗脫液，兩個小燒杯中的洗脫液用盡后，為洗脫充分，也可將所配制的剩余 30ml高離子強度洗脫液倒入小燒杯繼續(xù)洗脫，控制流速 。（一般洗 23個柱體積） ： 上樣前先準備好梯度洗脫液，本實驗采用 30ml TrisHCl緩沖液和 30ml含 1MNaCl的 TrisHCl緩沖液，進行線性梯度洗脫。（因 DEAE纖維素昂貴，用后務必回收）。 ⑵上樣向?qū)游鲋鶅?nèi)傾入樣品液 ⑶洗脫與收集 不同樣品選用的洗脫液不同。另外要注意的是離子交換劑使用前要排除氣泡，否則會影響分離效果。處理時一般陽離子交換劑最后用堿處理，陰離子交換劑最后用酸處理。干粉狀的離子交換劑首先要進行膨化，將干粉在水中充分溶脹，以使離子交換劑顆粒的孔隙增大，具有交換活性的電荷基團充分暴露出來。 pH值降低時，抑制蛋白質(zhì)陰離子化，隨之降低了蛋白質(zhì)對陰離子交換劑的吸附。當 Cl的濃度大時，蛋白質(zhì)不容易被吸附，吸附后也易于被洗脫，當 Cl濃度小時，蛋白質(zhì)易被吸附，吸附后也不容易被洗脫。 在適當?shù)柠}濃度下，溶液的 pH值高于等電點時，蛋白質(zhì)被陰離子交換劑所吸附；當溶液的 pH值低于等電點時，蛋白質(zhì)被陽離子交換劑所吸附。 溶液的 pH值與蛋白質(zhì)等電點相同時，凈電荷為 0，當溶液 pH值大于蛋白質(zhì)等電點時，則羧基游離，蛋白質(zhì)帶 負電荷 。如二乙氨乙基（ Dicthylaminoethyl， DEAE）。 凝膠過濾層析 利用一定大小孔隙的具有網(wǎng)狀結(jié)構的凝膠作層析介質(zhì)（如葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠、聚丙烯酰胺凝膠等），根據(jù)被分離物質(zhì)的分子大小、形狀不同擴散到凝膠孔隙內(nèi)的速度不同，因而通過層析柱的快慢不同而分離的一種層析法。 3. 乙醇沉淀 將熱級分 II轉(zhuǎn)入小燒杯中，放入冰?。]有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入 等體積 預冷至 20℃ 的 95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需 30分鐘，再在冰浴中放置 10分鐘，以沉淀完全。 （ 8）用廣泛 pH試紙檢查清液 pH，用 1M乙酸將 pH調(diào)至 ，稱為 “ 粗級分 I”。用滴管吸出上層有機相。 （ 4）緩慢加入預冷的 20ml去離子水，每次加 2ml左右，邊加邊研磨，至少用 30分鐘。 （ 2）稱取 2g干啤酒酵母，稱 10mg蝸牛酶及適量（約 4g）二氧化硅，放入研缽中。 超聲波處理法：用一定功率的超聲波處理細胞懸液，使細胞急劇震蕩破裂，此法多適用于微生物材料。比活力為每毫克蛋白質(zhì)的活力單位數(shù)。在細胞膜內(nèi)側(cè)細胞質(zhì)中的稱之為 內(nèi)蔗糖酶 ，含有少量的糖。蔗糖酶（ invertase）（ βD呋喃果糖苷果糖水解酶）（ ）特異地催化非還原糖中的 β呋喃果糖苷鍵水解，具有相對專一性。學習酶的純化方法，酶蛋白分離提純的原理。 酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究 自 1860年 Bertholet從啤酒酵母（ Sacc
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