酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究-預覽頁
【正文】 hayces Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來，它已被廣泛地進行了研究。該酶以兩種形式存在于酵母細胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細胞膜外細胞壁中的稱之為 外蔗糖酶 ，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。 名稱 MW 糖含量 亞基 為蔗糖的 Km 為棉子糖的 Km pI 最適 pH 穩(wěn)定 pH 最適溫度 外酶 27萬 50% 雙 26mM 150 mM 60℃ 內(nèi)酶 ＜ 3% 雙 25mM 150 mM 60℃ 實驗中，用測定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來測定蔗糖水解的速度，在給定的實驗條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。 反復凍融法：將細胞在 20度以下冰凍，室溫融解，反復幾次，由于細胞內(nèi)冰粒形成和剩余細胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細胞結(jié)構(gòu)破碎。 （一）蔗糖酶的提取與部分純化 （ 1）準備一個冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細胞大部分研碎。 如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。 （ 3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出 及蛋白質(zhì)含量（稱為 “ 熱級分 II”）?？梢赃x用生物化學、免疫化學或其他結(jié)構(gòu)上吻合等親和作用而設(shè)計的各種層析分離方法。 在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團，當結(jié)合陽離子基團時，可換出陰離子，則稱為 陰 離子交換劑。纖維素分子上帶有負電荷的陰離子（纖維素－ O－ CH2－ COO），其反離子為陽離子（如 Na+等） ,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進行交換。反之則越少。 交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機鹽離子（如 NaCl）都具有交換吸附的能力，當兩者同時存在于一個層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。 pH值增高時，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。 離子交換劑使用前一般要進行處理。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為 Na型（即平衡離子是 Na離子），陰離子交換劑為 Cl型，因為通常這樣比較穩(wěn)定。處理時應注意酸堿濃度不宜過高、處理時間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。 離子交換柱層析純化蔗糖酶 操作步驟 ： 稱取 DEAE纖維素（ DE23）干粉，加入 NaOH溶液（約 50ml），輕輕攪拌，浸泡至少 （不超過 1小時），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加 50ml M HCl, 攪勻，浸泡 時，同上，用去離子水洗至近中性，再用 M NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。 ： 先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用 mol/L pH TrisHCl 緩沖液洗瓊脂糖凝膠幾次，裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導率與緩沖液相同或接近時即可上樣。取 （即醇級分 Ⅲ 樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量），將剩余的上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管。 各級分蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮蘭染料法（ Bradford法）的微量法測定蛋白質(zhì)含量，參見 實驗－ “ 蛋白質(zhì)含量的測定法 ” 。其 原理 是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。 堿性銅試劑 100℃ 水浴加熱 8min，立即用自來水冷卻 磷鉬酸試劑 H2O A650nm 酶活力單位 酶（活力）單位 ：在一定條件下，一定時間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需
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