酵母蔗糖酶的提取及其性質(zhì)研究-預(yù)覽頁
【正文】 hayces Cerevisiae）中發(fā)現(xiàn)了蔗糖酶以來，它已被廣泛地進(jìn)行了研究。該酶以兩種形式存在于酵母細(xì)胞膜的外側(cè)和內(nèi)側(cè)，在細(xì)胞膜外細(xì)胞壁中的稱之為 外蔗糖酶 ，其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有 50% 糖成分的糖蛋白。 名稱 MW 糖含量 亞基 為蔗糖的 Km 為棉子糖的 Km pI 最適 pH 穩(wěn)定 pH 最適溫度 外酶 27萬 50% 雙 26mM 150 mM 60℃ 內(nèi)酶 ＜ 3% 雙 25mM 150 mM 60℃ 實(shí)驗(yàn)中，用測定生成還原糖（葡萄糖和果糖）的量來測定蔗糖水解的速度，在給定的實(shí)驗(yàn)條件下，每分鐘水解底物的量定為蔗糖酶的活力單位。 反復(fù)凍融法：將細(xì)胞在 20度以下冰凍，室溫融解，反復(fù)幾次，由于細(xì)胞內(nèi)冰粒形成和剩余細(xì)胞液的鹽濃度增高引起溶脹，使細(xì)胞結(jié)構(gòu)破碎。 （一）蔗糖酶的提取與部分純化 （ 1）準(zhǔn)備一個(gè)冰浴，將研缽穩(wěn)妥放入冰浴中。研磨時(shí)用顯微鏡檢查研磨的效果，至酵母細(xì)胞大部分研碎。 如果中間白色的脂肪層厚，說明研磨效果良好。剩余部分轉(zhuǎn)入清潔離心管中。 （ 3）將上清液轉(zhuǎn)入量筒，量出體積，留出 及蛋白質(zhì)含量（稱為 “ 熱級分 II”）?？梢赃x用生物化學(xué)、免疫化學(xué)或其他結(jié)構(gòu)上吻合等親和作用而設(shè)計(jì)的各種層析分離方法。 在纖維素與葡聚糖分子上結(jié)合有一定的離子基團(tuán)，當(dāng)結(jié)合陽離子基團(tuán)時(shí)，可換出陰離子，則稱為 陰 離子交換劑。纖維素分子上帶有負(fù)電荷的陰離子（纖維素－ O－ CH2－ COO），其反離子為陽離子（如 Na+等） ,可與帶正電荷蛋白質(zhì)陽離子進(jìn)行交換。反之則越少。 交換劑對膠體離子（如蛋白質(zhì)）和無機(jī)鹽離子（如 NaCl）都具有交換吸附的能力，當(dāng)兩者同時(shí)存在于一個(gè)層析過程中，則產(chǎn)生競爭性的交換吸附。 pH值增高時(shí)，抑制蛋白質(zhì)陽離子化，隨之對陽離子交換劑的吸附力減弱。 離子交換劑使用前一般要進(jìn)行處理。市售的離子交換劑中通常陽離子交換劑為 Na型（即平衡離子是 Na離子），陰離子交換劑為 Cl型，因?yàn)橥ǔ＿@樣比較穩(wěn)定。處理時(shí)應(yīng)注意酸堿濃度不宜過高、處理時(shí)間不宜過長、溫度不宜過高，以免離子交換劑被破壞。交換劑在柱內(nèi)必須分布均勻。 離子交換柱層析純化蔗糖酶 操作步驟 ： 稱取 DEAE纖維素（ DE23）干粉，加入 NaOH溶液（約 50ml），輕輕攪拌，浸泡至少 （不超過 1小時(shí)），用玻璃砂漏斗抽濾，并用去離子水洗至近中性，抽干后，放入小燒杯中，加 50ml M HCl, 攪勻，浸泡 時(shí)，同上，用去離子水洗至近中性，再用 M NaOH重復(fù)處理一次，用去離子水洗至近中性后，抽干備用。 ： 先將層析柱垂直裝好，在燒杯內(nèi)用 mol/L pH TrisHCl 緩沖液洗瓊脂糖凝膠幾次，裝柱，然后用此緩沖液洗柱至流出液的電導(dǎo)率與緩沖液相同或接近時(shí)即可上樣。取 （即醇級分 Ⅲ 樣品，留待下一個(gè)實(shí)驗(yàn)測酶活力及蛋白含量），將剩余的上清液小心地加到層析柱上，不要擾動(dòng)柱床，注意要從上樣開始使用部分收集器收集，每管。 各級分蛋白質(zhì)含量的測定 采用考馬斯亮蘭染料法（ Bradford法）的微量法測定蛋白質(zhì)含量，參見 實(shí)驗(yàn)－ “ 蛋白質(zhì)含量的測定法 ” 。其 原理 是在酸性條件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成一分子葡萄糖和一分子果糖。 堿性銅試劑 100℃ 水浴加熱 8min，立即用自來水冷卻 磷鉬酸試劑 H2O A650nm 酶活力單位 酶（活力）單位 ：在一定條件下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需
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