多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增dna片斷(編輯修改稿)
2025-06-22 06:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 。一般 GC含量每增加 1%，解鏈溫度增加 ℃ 。哺乳動物基因組 DNA中 GC含量在 40%時，解鏈溫度約為 87℃ ；其含量在 60%時， 解鏈溫度約為 95℃ 。 DNA。 DNA變性所需要的溫度和時間取決于 DNA的復(fù)雜性、 GC含量、擴(kuò)增儀和種類和 PCR反應(yīng)的體積等 。在一般 PCR中，變性溫度為 90～ 95℃ ，加熱時間 1～ 2min. PCR原理 ② 當(dāng)溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的 DNA鏈又會重新結(jié)合成雙鏈 ③ PCR利用了 DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結(jié)合，現(xiàn)在使用的 PCR儀實(shí)質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導(dǎo)致 DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的 Taq DNA聚合酶解決了高溫導(dǎo)致 DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術(shù)的自動化。 Taq DNA聚合酶的應(yīng)用 緩沖液需要為 PCR反應(yīng)提供的物質(zhì) DNA模板，分別與兩條模板鏈相結(jié)合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的 DNA聚合酶，同時通過控制溫度使 DNA復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行。 PCR技術(shù)是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴(kuò)增技術(shù)。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復(fù)性好、易自動化等突出 PCR技術(shù)的特點(diǎn) 細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外 DNA復(fù)制環(huán)境的區(qū)別 體內(nèi) DNA的復(fù)制 體外的模擬 模板（母鏈） 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物 dNTP 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 聚合酶 細(xì)胞內(nèi)源 外源加入 反應(yīng)環(huán)境 細(xì)胞內(nèi)環(huán)境 緩沖液 ① PCR過程需要的引物是 RNA或 DNA，而是人工合成的 DNA單鏈，其長度通常為 20－ 30個脫氧核苷酸 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和 PCR不同點(diǎn) ② PCR過程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應(yīng)溫度的控制來實(shí)現(xiàn)的 細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制 PCR 不同點(diǎn) 解旋 解旋酶，邊解旋邊復(fù)制 80～ 100℃ 高溫解旋，雙鏈完全分開 酶 DNA解旋酶， DNA聚合酶，DNA連接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或 RNA 能量 ATP 不加 溫度 體內(nèi)溫和條件 高溫 子鏈合成 一條鏈連續(xù)（先導(dǎo)鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由 DNA連接酶連接（滯后鏈） 兩條子鏈均連續(xù)合成 相同點(diǎn) ① 需要提供 DNA復(fù)制模板 ②四種脫氧核苷酸作為原料 ③子鏈延伸的方向都是從 5’端到 3’端 細(xì)胞內(nèi) DNA的復(fù)制與 PCR的比較 DNA聚合酶與 DNA連接酶的異同 DNA聚合酶 DNA連接酶 不同點(diǎn) 作用 單個核苷酸加到已有的單鏈片段的 3’羥基上 連接兩條 DNA片段的缺口 是否需要模板 需要 不需要 相同點(diǎn) 都是形成磷酸二酯鍵 （五） PCR的反應(yīng)過程 PCR的反應(yīng)步驟 PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟 ── 變性、復(fù)性和延伸 ① 變性（模板 DNA解旋） 模板 DNA經(jīng)加熱至 900C以上。
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