多聚酶鏈式反應擴增dna片斷(編輯修改稿)
2025-06-22 06:19 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 。一般 GC含量每增加 1%，解鏈溫度增加 ℃ 。哺乳動物基因組 DNA中 GC含量在 40%時，解鏈溫度約為 87℃ ；其含量在 60%時， 解鏈溫度約為 95℃ 。 DNA。 DNA變性所需要的溫度和時間取決于 DNA的復雜性、 GC含量、擴增儀和種類和 PCR反應的體積等 。在一般 PCR中，變性溫度為 90～ 95℃ ，加熱時間 1～ 2min. PCR原理 ② 當溫度緩慢降低后，兩條彼此分離的 DNA鏈又會重新結合成雙鏈 ③ PCR利用了 DNA的熱變性原理，通過控制溫度來控制雙鏈的解聚與結合，現(xiàn)在使用的 PCR儀實質(zhì)上也是一臺能夠自動調(diào)控溫度的儀器 高溫解決了打開雙鏈的問題，但是，又導致 DNA聚合酶失活的問題，耐高溫的 Taq DNA聚合酶解決了高溫導致 DNA聚合酶失活的問題，促成了PCR技術的自動化。 Taq DNA聚合酶的應用 緩沖液需要為 PCR反應提供的物質(zhì) DNA模板，分別與兩條模板鏈相結合的兩種引物，四種脫氧核苷酸，耐熱的 DNA聚合酶，同時通過控制溫度使 DNA復制在體外反復進行。 PCR技術是 80年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術。 它具有特異、敏感、產(chǎn)率高、 快速、 簡便、重復性好、易自動化等突出 PCR技術的特點 細胞內(nèi)和細胞外 DNA復制環(huán)境的區(qū)別 體內(nèi) DNA的復制 體外的模擬 模板（母鏈） 細胞內(nèi)源 外源加入 引物 引物合成酶 外源加入 底物 dNTP 細胞內(nèi)源 外源加入 聚合酶 細胞內(nèi)源 外源加入 反應環(huán)境 細胞內(nèi)環(huán)境 緩沖液 ① PCR過程需要的引物是 RNA或 DNA，而是人工合成的 DNA單鏈，其長度通常為 20－ 30個脫氧核苷酸 細胞內(nèi)復制和 PCR不同點 ② PCR過程中 DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通過對反應溫度的控制來實現(xiàn)的 細胞內(nèi) DNA的復制 PCR 不同點 解旋 解旋酶，邊解旋邊復制 80～ 100℃ 高溫解旋，雙鏈完全分開 酶 DNA解旋酶， DNA聚合酶，DNA連接酶 TaqDNA聚合酶 引物 RNA DNA或 RNA 能量 ATP 不加 溫度 體內(nèi)溫和條件 高溫 子鏈合成 一條鏈連續(xù)（先導鏈），另一條鏈不連續(xù)，先合成片段，再由 DNA連接酶連接（滯后鏈） 兩條子鏈均連續(xù)合成 相同點 ① 需要提供 DNA復制模板 ②四種脫氧核苷酸作為原料 ③子鏈延伸的方向都是從 5’端到 3’端 細胞內(nèi) DNA的復制與 PCR的比較 DNA聚合酶與 DNA連接酶的異同 DNA聚合酶 DNA連接酶 不同點 作用 單個核苷酸加到已有的單鏈片段的 3’羥基上 連接兩條 DNA片段的缺口 是否需要模板 需要 不需要 相同點 都是形成磷酸二酯鍵 （五） PCR的反應過程 PCR的反應步驟 PCR一般經(jīng)歷三十多次循環(huán)，每次循環(huán)可以分為三個基本步驟 ── 變性、復性和延伸 ① 變性（模板 DNA解旋） 模板 DNA經(jīng)加熱至 900C以上。
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