聚合酶鏈式反應(yīng)polymerasechainreaction(編輯修改稿)
2024-08-28 13:50 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 10 1 鎂離子 25 mmol/L dNTP 25 mmol/L 200mmol/L Taq DNA聚合酶 1U/ml 模板 DNA 100ng/ml 其它反應(yīng)因素 ? pH應(yīng)保持在酶反應(yīng)所需的最適 pH ? 鹽濃度（引物與模板雜交率、雜交體穩(wěn)定性 及聚合酶的活性） ? 二甲亞砜（ DMSO） 能破壞模板的二級結(jié)構(gòu) ? 牛血清白蛋白或明膠等基質(zhì)可以保護 Taq 酶 的活性 循環(huán)次數(shù) ? 重復次數(shù)一般設(shè)為 25～ 35個循環(huán) ? 35個循環(huán)以后由于反應(yīng)體系中各種反應(yīng)組分的消耗和反應(yīng)副產(chǎn)物的產(chǎn)生，此時擴增產(chǎn)物量不再隨 循環(huán)次數(shù)的增加而呈指數(shù)增長，即反應(yīng)已處于平 臺期 ? 指數(shù)增長期 ? 線形增長期 ? 平臺期 循環(huán)數(shù) 理論值 實際值 Log 產(chǎn)物DNA PCR過程的實時監(jiān)測 相對定量 PCR 設(shè)計相對定量 PCR實驗方案時須注意： ? 預先確定最佳模板量和 PCR循環(huán)數(shù)，使所 采用的各反應(yīng)參數(shù)在擴增指數(shù)范圍內(nèi)，避 免平臺效應(yīng)。 ? “管家基因”與靶基因同管擴增 ， 擴增產(chǎn)物 的長度應(yīng)有所不同，以保證電泳能將兩者 分離開。 理論值 實際值 Log 產(chǎn)物DNA 絕對定量 PCR ? 實時定量 PCR 對核酸擴增反應(yīng)進行直接和動態(tài)的監(jiān)測， 實現(xiàn)對靶基因的實時定量分析 TaqManTM 5’ 5’ 3’ 3’ Thermal Stable DNA Polymerase Primers Add Master Mix and Sample Denaturation Annealing Reaction Tube Taq l R Q Probe R Q 5’ 3’ TaqManTM Extension Step 5’ 3’ 1. Strand Displacement Taq Q R 5’ 3’ Q Taq R 5’ 2. Cleavage 3. Polymerization Complete 5’ 3’ Taq R 5’ 4. Detection 5’ 3’ Taq R 5’ l R R Q
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