【文章內(nèi)容簡介】 CaCl2 法 ) 將培養(yǎng)液轉入離心管中 ,冰上放置 10分鐘 ,然后于 4℃下 3000g離心 10分鐘。 棄去上清 ,用預冷的 ,冰上放置 1530分鐘后 ,4℃下 3000g離心 10分 鐘。 棄去上清 ,加入 4ml預冷含 15%甘油的 ,輕輕懸浮細胞 ,冰上放置幾分鐘 ,即成感受態(tài)細胞懸液。 感受態(tài)細胞分裝成 200μ l的小份 ,貯存于 70℃可保存半年。 三、 轉化 從 70℃冰箱中取 200μ l感受態(tài)細胞懸液 ,室溫下使其解凍 ,解凍后立即置冰上。 加入 pBS質(zhì)粒 DNA溶液 (含量不超過 50ng,體積不超過 10μ l),輕輕搖勻 ,冰上放置30分鐘后。 42℃水浴中熱擊 90秒或 37℃水浴 5分鐘 ,熱擊后迅速置于冰上冷卻 35分鐘。 向管 中加入 1ml LB液體培養(yǎng)基 (不含 Amp),混勻后 37℃振蕩培養(yǎng) 1小時 ,使細菌恢復正常生長狀態(tài) ,并表達質(zhì)粒編碼的抗生素抗性基因 (Ampr )。 將上述菌液搖勻后取 100μ l 涂布于含 Amp的篩選平板上 ,正面向上放置半小時 ,待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿 ,37℃培養(yǎng) 1624小時。 同時做兩個對照 : 對照組 1: 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA溶液 ,其它操作與上面相同。此組正常情況下在含抗生素的 LB平板上應沒有菌落出現(xiàn)。 對照組 2: 以同體積的無菌雙蒸水代替 DNA溶液 ,但涂板時只取 5μ l 菌液涂 布于不含抗生素的 LB平板上，此組正常情況下應產(chǎn)生大量菌落。 四、 計算轉化率 統(tǒng)計每個培養(yǎng)皿中的菌落數(shù)。 轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據(jù)此皿中的菌落數(shù)可計算出轉化子總數(shù)和轉化頻率，公式如下： 轉化子總數(shù)＝菌落數(shù)稀釋倍數(shù)轉化反應原液總體積／涂板菌液體積 轉化頻率（轉化子數(shù)／每 mg質(zhì)粒 DNA）＝轉化子總數(shù)／質(zhì)粒 DNA加入量 (mg) 感受態(tài)細胞總數(shù)＝對照組２菌落數(shù)稀釋倍數(shù)菌液總體積／涂板菌液體積 感受態(tài)細胞轉化效率＝轉化子總數(shù)／感受態(tài)細胞總數(shù) 四，注意事項 本 實驗方法也適用于其它 DNA的轉化。但它們的轉化效率并不一定一樣。有的轉化效率高，需將轉化液進行多梯度稀釋涂板才能得到單菌落平板 ,而有的轉化效率低 ,涂板時必須將菌液濃縮 (如離心 ),才能較準確的計算轉化率。 實驗四 RNA的提取和 cDNA合成 一， 概 述 從真核生物的組織或細胞中提取 mRNA,通過酶促反應逆轉錄合成 cDNA的第一鏈和第二鏈 ,將雙鏈 cDNA 和載體連接 ,然后轉化擴增 , 即可獲得 cDNA 文庫 ,構建的 cDNA 文庫可用于真核生物基因的結構、表達和調(diào)控的分析 。比較 cDNA 和相應基因組 DNA 序列差異可確定內(nèi)含子存在和了解轉錄后加工等一系列問題。總之 cDNA 的合成和克隆已成為當今真核分子生物學的基本手段。自 70 年代中葉首例 cDNA 克隆問世以來 ,已發(fā)展了許多種提高 cDNA 合成效率的方法 ,并大大改進了載體系統(tǒng)，目前 cDNA 合成試劑已商品化。 cDNA 合成及克隆的基本步驟包括用反轉錄酶合成 cDNA 第一鏈 ,聚合酶合成 cDNA 第二鏈 ,加入合成接頭以及將雙鏈 DNA 克隆到于適當載體 (噬菌體或質(zhì)粒 )。 二，材料、設備及試劑 一、材料 水稻葉片或小鼠肝組織。 二、設備 研缽， 冷凍臺式高速離心機，低溫冰箱，冷凍真空干燥器，紫外檢測儀，電泳儀，電泳槽。 三、試劑 無 RNA酶滅菌水：用將高溫烘烤的玻璃瓶（ 180℃ 2小時）裝蒸餾水，然后加入 %的 DEPC（體積 /體積），處理過夜后高壓滅菌。 75%乙醇：用 DEPC處理水配制 75%乙醇，（用高溫滅菌器皿配制），然后裝入高溫烘烤的玻璃瓶中，存放于低溫冰箱。 1層析柱加樣緩沖液； 20mmol/L Tris Cl()， ， 1mmol/L EDTA()， % SDS。 洗脫緩沖液： 10mmol/L Tris Cl ()， 1mmol/L EDTA ()， % SDS。 EDTA (50mM和 200mM)， TE飽和酚 :氯仿（ 1:1）， NH4Ac，乙醇 (100%和 70%)，TE緩沖液。 三，操作步驟 （一）動植物總 RNA提取 Trizol法 Trizol法適用于人類、動物、植物、微生物的組織或培養(yǎng)細菌，樣品量從幾十毫克至幾克。用 Trizol法提取的總 RNA絕無蛋白和 DNA污染。 RNA可直接用于 Northern斑點分析， 斑點雜交， Poly(A)+分離，體外翻譯， RNase封阻分析和分子克隆。 將組織在液 N中磨成粉末后，再以 50100mg組織加入 1ml Trizol液研磨，注意樣品總體積不能超過所用 Trizol體積的 10%。 研磨液室溫放置 5分鐘，然后以每 1mlTrizol液加入 ，蓋緊離心管，用手劇烈搖蕩離心管 15秒。 取上層水相于一新的離心管，按每 mlTrizol液加 ，室溫放置 10分鐘， 12020g離心 10分鐘。 棄去上清液，按每 ml Trizol液加入至少 1ml的比例加入 75%乙醇，渦旋混勻， 4℃下 7500g離心 5分鐘。 小心棄去上清液，然后室溫或真空干燥 510分鐘，注意不要干燥過分，否則會降低 RNA的溶解度。然后將 RNA溶于水中，必要時可 55℃ 60℃水溶 10分鐘。 RNA可進行mRNA分離，或貯存于 70%乙醇并保存于 70℃。 [注意 ] 整個操作要帶口罩及一次性手套，并盡可能在低溫下操作。 加氯仿前的勻漿液可在 70℃保存一個月以上， RNA沉淀在 70%乙醇中可在 4℃保存一周， 20℃保存一年。 （二） mRNA提取 由于 mRNA末端含有多 poly(A)+，當總 RNA流徑 oligo(dT)纖維素時，在高鹽緩沖液作用下， mRNA被特異的吸附在 oligo(dT)纖維素柱上，在低鹽濃度或蒸餾水中， mRNA可被洗下，經(jīng)過兩次 oligo(dT) 纖維素柱，可得到較純的 mRNA。 用 (dT)纖維素。 將懸浮液裝入滅菌的一次性層析柱中或裝入填有經(jīng) DEPC處理并經(jīng)高壓滅菌的玻璃棉的巴斯德吸管中，柱床體積為 ，用 3倍柱床體積的滅菌水沖洗柱床。 用 1x柱層析加樣緩沖液沖洗柱床，直到流出液的 pH值小于 。 將（一）中提取的 RNA液于 65℃溫育 5分鐘后迅速冷卻至室溫，加入等體積 2x柱層析緩沖液，上樣，立即用滅菌試管收集洗出液，當所有 RNA溶液進入柱床后，加入 1倍柱床體積的 1x層析柱加樣溶液。 測定每一管的 OD260，當洗出液中 OD為 0時，加入 23倍柱床體積的滅菌洗脫緩沖液， 以 1/3至 1/2柱床體積分管收集洗脫液。 測定 OD260，合并含有 RNA的洗脫組分。 加入 1/10體積的 3M NaAc()， 冰冷乙醇， 混勻， 20℃ 30分鐘。 4℃下 12020g離心 15分鐘，小心棄去上清液，用 70%乙醇洗 滌沉淀， 4℃下 12020g離心 5分鐘。 小心棄去上清液，沉淀空氣干燥 10分鐘，或真空干燥 10分鐘。 用少量水溶解 RNA液，即可用于 cDNA合成（或保存在 70%乙醇中并貯存于 70℃）。 [注意 ] mRNA在 70%乙醇中 70℃可保存一年以上。 oligo(dT)纖維素柱用后可用 ，然后用層析柱加樣緩沖液平衡，并加入 %疊氮鈉（ NaN3)冰箱 保存，重復使用。每次用前需用 NaOH水層析柱加樣緩沖液依次淋洗柱床。 （三） cDNA第一鏈合成 (1) 取一滅菌的無 RNA酶的 eppendorf管 ,加入 RNA模板和適當引物 ,每μ g RNA使用 g引物 (如使用 NotⅠ引物接頭 ,使用 g),用 H2 O調(diào)整體積至 15μ l, 70℃處理 5分鐘 ,冷卻至室溫 ,離心使溶液集中在管底 ,再依次加入 5第一鏈緩沖液 5μ l rRNasin RNA酶抑制劑 25U MMLV(H )反轉錄酶 200U H2 O 調(diào)至總體積 25μ l (2) 用手指 輕彈管壁 ,吸取 5μ l至另一 eppendorf管，加入 25μ Ci [α 32 P] dCTP (400Ci/mmol),用以第一鏈同位素摻入放射性活性測定。 (3) 37℃ (隨機引物 )或 42℃ (其它引物 )溫浴 1小時 (4) 取出置于冰上 (5) 摻入測定的 eppendorf管加入 95μ l 50mM EDTA終止反應 ,并使總體積為 100μ l?？扇?90μ l進行電泳分析 (先用苯酚抽提 ),另 10μ l進行同位素摻入放射性活性測定。 (6) 第一鏈合成 eppendorf管可直接用于第二鏈合成 注：以上 25μ l反應總體積中所用 RNA量為 1μ g,如合成 5μ g RNA,則可按比例擴大反應體積 , 倒 5μ g RNA使用 125μ l總體積進行合成。 （四） 第二鏈合成 取第一鏈反應液 20μ l, 再依次加入 10第二鏈緩沖液 20μ l DNA聚合酶Ⅰ 23μ RNase H H2O 加至終體積為 100μ l 輕輕混勻 ,如需進行第二鏈同位素摻入放射性活性測定 ,可取出 10μ l至另一eppendorf管 ,加入 25μ Ci[α 32 P] dCTP。 14℃溫浴 2小時 (如需合成長于 3kb的 cDNA, 則需延長至 34小時 )。 摻入測定 eppendorf管中加入 90μ l 50mM EDTA, 取 10μ l進行同位素摻入放射性測定 ,余下的可進行電泳分析。 cDNA第二鏈合成離心管反應液 70℃處理 10分鐘 , 低速離心后置冰上。 加入 2μ T4 DNA聚合酶 , 37℃溫浴 10分鐘。 加入 10μ l 200mmol/L EDTA終止反應。 用等體積酚 :氯仿抽提 cDNA反應液 ,離心 2分鐘。 水相移至另一 eppendorf管 ,加入 (或 體積的 ,), 混勻后再加入 (20℃ ), 20℃放置 30分鐘后離心 5分鐘。 小心丟去上清液 ,加入 70%乙醇 ,離心 2分鐘。 1 小心移去上清液 ,干燥沉淀。 1 沉淀溶于 1020μ l TE緩沖液。 （五） 電泳分析 通常合成的 cDNA第一鏈和第二鏈長度為 3506000堿基 ,需進行 %堿性瓊脂糖電泳。方法見實驗二。 實驗五 重組質(zhì)粒的連接、轉化及篩選 一， 概 述 在質(zhì)粒載體上進行克隆 ,從原理上說是很簡 單的，先用限制性內(nèi)切酶切割質(zhì)粒DNA和目的 DNA片段 , 然后體外使兩者相連接 , 再用所得到重組質(zhì)粒轉化細菌 ,即可完成。但在實際工作中 , 如何區(qū)分插入有外源 DNA的重組質(zhì)粒和無插入而自身環(huán)化的載體分子是較為困難的。通過調(diào)整連接反應中外源 DNA片段和載體 DNA的濃度比例 ,可以將載體的自身環(huán)化限制在一定程度之下 ,也可以進一步采取一些特殊的克隆策略 ,如載體去磷酸化等來最大限度的降低載體的自身環(huán)化 ,還可以利用遺傳學手段如α互補現(xiàn)象等來鑒別重組子和非重組子。 二，材料、設備及試劑 一、 材料 外源 DNA片段 : 自行制備的帶限制性末端的 DNA溶液 ,濃度已知 。 載體 DNA: pBS質(zhì)粒 (Ampr ,la