分子雜交技術(shù)ppt課件(2)(編輯修改稿)
2025-06-02 08:13 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 最適條件下，可以測出樣品中少于 1000個(gè)分子的核酸含量。 2） 放射性核素與相應(yīng)的元素具有完全相同的化學(xué)性質(zhì)，對酶促反應(yīng)無任何影響，不會影響堿基配對的特異性、穩(wěn)定性和雜交性質(zhì)。 3）特異性高，假陽性結(jié)果很少是由于放射性核素引起的。 其缺點(diǎn)是： 1）放射性污染。 2）過強(qiáng)的放射線可以造成核酸分子結(jié)構(gòu)的破壞。 3）半衰期短，標(biāo)記后立即使用（ 32P/ 35S/ 3H/ ）。 常用的放射性同位素有： 1） 32P放射性強(qiáng)，穿透性較強(qiáng)，因此自顯影所需時(shí)間短，靈敏度高。廣泛應(yīng)用于各種濾膜雜交和液相雜交。 射線散射嚴(yán)重，分辨率不高 2） 35S 可以取代磷酸分子上的一個(gè)氧原子，但分辨率高（可用于核酸序列測定及細(xì)胞原位雜交）。半衰期較長。 靈敏度較 P低 3） 3H 散射極少，半衰期長 自顯影時(shí)間較長 4） 125I 、 131I 散射小，分辨率高，顯影時(shí)間比 H短很多。 具有揮發(fā)性，吸入后蓄積 非放射性標(biāo)記物有下述幾類： ? 金屬如 Hg，熒光物質(zhì)如 FITC； ? 半抗原如地高辛； ? 生物素； ? 酶類如辣根過氧化物酶（ HRP）； ? 半乳糖苷酶或堿性磷酸酶（ AP）等。 ? 非放射性同位素 無放射性、穩(wěn)定性好 靈敏度及特異性不高 圖 204 生物素標(biāo)記核酸探針熒光免疫反應(yīng)圖解 圖 生物素標(biāo)記核酸探針熒光免疫反應(yīng)圖解 非放射性探針標(biāo)記的顯色體系 ? AP顯色體系 ： AP BCIP BCIOH + NBT→ 紫色 ↓ BCIP： 5溴 4氯 3吲哚磷酸， NBT：四氮唑藍(lán) ? HRP顯色體系 ： HRPH2O2 DAB–2NH2 棕色 ↓ + 2H+ +H2O ? ABC顯色體系 ： DNA –B + SA – AP→DNA – B – SAAP或 DNA – B +SA BAP→DNA –B –SA –BAP 經(jīng)上述兩反應(yīng)，把 AP連接在 DNA上以后，再進(jìn)行 AP酶顯色。 SA為 Streptavidin（鏈霉親合素）， BAP為生物素化的磷酸酶， B為生物素（ biotin）， ABC為 Avidin – Biotin Enzyme plex, 即親合素 生物素 酶復(fù)合物。 B和 SA還可以換成 DIG和 ANTI－ DIG 在選擇標(biāo)記方法時(shí)，應(yīng)考慮實(shí)驗(yàn)的要求 一般認(rèn)為放射性探針比非放射性探針的靈敏度高。在檢測單拷貝基因序列時(shí)，應(yīng)選用標(biāo)記效
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