酵母雙雜交系統(tǒng)ppt課件(編輯修改稿)
2025-02-13 19:22 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 。 待篩選的蛋白 Y或 BD結(jié)構(gòu)域同 AD結(jié)構(gòu)域融合，蛋白 Y上游序列或 BD與待目的 DNA序列結(jié)合，導(dǎo)致 AD激活了報告基因表達(dá)。 酵母單雜交系統(tǒng)應(yīng)用 ① 確定已知 DNA蛋白質(zhì)之間是否存在相互作用。 ②分離編碼結(jié)合于目的順式調(diào)控元件或其他短DNA結(jié)合位點蛋白的新基因。 ③定位已經(jīng)證實的具有相互作用的 DNA結(jié)合蛋白的 DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域以及準(zhǔn)確定位與 DNA結(jié)合的核苷酸序列。 研究 DNA蛋白質(zhì)相互作用 (二 ) 反向酵母雙雜交系統(tǒng) （ reverse yeast twohybrid system ） 1996年， Vidal等人建立了反向酵母雙雜交系統(tǒng) Vidal M, Brachmann RK, Fattaey A, Harlow E, Boeke JD. Reverse twohybrid and onehybrid systems to detect dissociation of proteinprotein and DNAprotein interactions. Proc Natl Acad Sci USA， 1996， 93(19):1031510320. (二 ) 反向酵母雙雜交系統(tǒng) （ reverse yeast twohybrid system ） ? 該系統(tǒng)是一項鑒定 阻斷 蛋白間相互作用的技術(shù)，核心在于構(gòu)建一種反向篩選的報告基因。 ? 在這系統(tǒng)中，野生型 BDX/ADY間的相互作用激活一種 毒性標(biāo)志 作為報告基因，對酵母宿主是毒性或致死性的，即所謂的 陰性 篩選。 ? 在此情況下 BDX/ADY作用的解離 賦予酵母一種選擇生長優(yōu)勢。 ? 利用這種方法能方便地鑒定 作用缺陷等位基因 、 解離肽或相關(guān)的小分子物質(zhì) 。 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 反向雙雜交系統(tǒng)基本原理示意圖 雙雜交產(chǎn)生的相互作用激活 Tet阻遏蛋白，從而抑制陽性篩選標(biāo)志 His3的表達(dá)，此時野生型相互作用使宿主細(xì)胞表現(xiàn)為組氨酸營養(yǎng)缺陷型 。 反向酵母雙雜交系統(tǒng)的應(yīng)用 ? 用于篩選缺陷等位基因的研究 在穩(wěn)定、全長及能夠形成正確蛋白質(zhì)折疊的條件下，已有了幾種遺傳學(xué)策略來篩選作用缺陷性等位基因。 ? 在反式作用解離分子方面的應(yīng)用 ? 在蛋白質(zhì)組研究方面的應(yīng)用 利用反向雙雜交系統(tǒng)對文庫進行預(yù)清除，則可能大大減輕以后的假陽性鑒定工作。反向雙雜交系統(tǒng)作為正向雙雜交系統(tǒng)的補充，提出了創(chuàng)建整個有機體蛋白質(zhì)連鎖圖譜的設(shè)想。 第一部分 用酵母雙雜交系統(tǒng)從人睪丸 cDNA文庫初步篩選與 CK2α′相互作用蛋白的候選克隆 材料 pGBKT7HCK2α′ 梁景耀構(gòu)建 Human Testis MATCHMARKER cDNA Library Clontech公司 方法 人睪丸組織 cDNA文庫質(zhì)粒的擴增與抽提 (1) cDNA文庫的滴度測定 (2) 文庫擴增：根據(jù)滴度和獨立克隆數(shù)計算所需文庫 原始菌液體積及鋪皿個數(shù)（共涂布 110塊 LB/Amp 培養(yǎng)基 ) (3) 收集培養(yǎng)基上生長的菌落，制備文庫質(zhì)粒 1 材料與方法 (二 )反向酵母雙雜交系統(tǒng) （ reverse yeast twohybrid system ） ? 毒性報告基因 包括 URA3和 CYH2等。 ? 酵母 URA3基因產(chǎn)物一方面為合成尿嘧啶所必需，同時又能催化 5FOA（ 5氟乳清酸）轉(zhuǎn)變?yōu)槎拘晕镔|(zhì)。 ? URA3既可作為陰性篩選標(biāo)志 (在含有 5FOA的培養(yǎng)基中 )、又可作為陽性篩選標(biāo)志 (在不含 5FOA的培養(yǎng)基中 )，因此應(yīng)用得更廣泛。 用誘餌質(zhì)粒 pGBKT7HCK2α′篩選文庫 (1) 酵母 AH109(pGBKT7HCK2 α′）感受態(tài)制備 (醋酸鋰法） (2) 文庫轉(zhuǎn)化（分步轉(zhuǎn)化法 ) (3) 檢測文庫轉(zhuǎn)化效率 (4) 初步篩選陽性候選克隆 轉(zhuǎn)化混合物接種在 75塊 SD/His/Leu/Trp培養(yǎng)基中 陽性克隆重新在 SD/Ade/His/Leu/Trp培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng) β半乳糖苷酶濾膜影印法初步篩選出陽性候選克隆的轉(zhuǎn)化株 2 結(jié)果 文庫的擴增與抽提 文庫滴度為 109 cfu /ml ； 文庫轉(zhuǎn)化效率為 105 cfu/μg ； 共得轉(zhuǎn)化子約 107 β半乳糖苷酶濾膜影印分析法鑒定的真陽 性克隆結(jié)果 138個克隆呈現(xiàn)藍(lán)色，為陽性候選克隆 3 討論 ?酵母株 AH109的表型 (Ade， His， Leu， Trp ） 及用以篩選的原理 ?酵母篩選的嚴(yán)謹(jǐn)性 ?高嚴(yán)謹(jǐn)性 ?低嚴(yán)謹(jǐn)性 ?最低嚴(yán)謹(jǐn)性 第二部分 相互作用蛋白的進一步確證、 cDNA序列測定及其同源性分析 pGADT7Rec AD 載體 共轉(zhuǎn)化感受態(tài) 酵母菌 AH109 總 RNA HL60細(xì)胞 HL60細(xì)胞 cDNA文庫 人 CK2α39。亞基 cDNA 重組質(zhì)粒 PCR擴增 Nde I/Pst I 人 CK2α39。cDNA pGBKT7 誘鉺蛋白基因 多克隆位點 DNABD 載體 測序驗證 驗證蛋白表達(dá)排除自主激活 接種在 SD/Leu/Trp/His/Ade的 缺陷培養(yǎng)基中 , 生長 57天 (可以生長且 β半乳糖苷酶陽性為真陽性克隆 ) 擴增純化陽性克隆中質(zhì)粒 DNA 以 T7Promoter為測序引物 測定文庫中與 CK2α39。亞基相互作用蛋白的 cDNA序列 用 GenBank 軟件包作序列同源性分析，確定相互作用蛋白名稱 提取酵母質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài) JM109以實現(xiàn)文庫質(zhì)粒的分離并與 BD質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化 AH109以實現(xiàn)一對一回復(fù)性雜交 陽性候選克隆在 SD/Ade/His/Leu/Trp培養(yǎng)基上重新劃線培養(yǎng) 各挑取 10個 β半乳糖苷酶陽性克隆 , 提取質(zhì)粒 PCR擴增文庫質(zhì)粒 cDNA插入片段 限制性酶切分析 1 方 法 陽性候選克隆的鑒定與分組 (將第一部分實驗中獲得的 1～ 24號陽性候選 克隆用
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