分子生物學(xué)載體ppt課件(編輯修改稿)
2025-05-30 18:09 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 去毒性。（ 4） neor（ Kanr） 氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶使 G418 （卡那霉素衍生物）失活（ 5） Hygr 使潮霉素 β 失活。如何閱讀質(zhì)粒圖譜? （ MCS）。它具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)。便于外源基因的插入。如果在這些位點(diǎn)外有外源基因的插入，會(huì)導(dǎo)致某種標(biāo)志基因的失活，而便于篩選。決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。? DNA插入片段大小。質(zhì)粒一般只能容納小于 10Kb的外源 DNA片段。一般來(lái)說(shuō)，外源DNA片段越長(zhǎng)，越難插入，越不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化效率越低。如何閱讀質(zhì)粒圖譜? ，即 啟動(dòng)子－核糖體結(jié)合位點(diǎn)－克隆位點(diǎn)－轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)。 這是用來(lái)區(qū)別克隆載體與表達(dá)載體。? University of California 的的 J. Messing 和和 J. Vieria 于于 1978年，在年，在 pBR322的基礎(chǔ)上改造而成，如的基礎(chǔ)上改造而成，如 pUC pUC pUC pUC pUC1 pUC1 pUC19。 ? ? ? 元件來(lái)源元件來(lái)源 ①① 復(fù)制起點(diǎn)：復(fù)制起點(diǎn)： pBR322的的 ori ②② Ampr 基因：基因： pBR322的的 Ampr基因，但其上失去了克基因，但其上失去了克 隆位點(diǎn)。隆位點(diǎn)。 ③③ lacZ’基因：大腸桿菌基因：大腸桿菌 lacZ的的 ?肽鏈序列，肽鏈序列， 是是 LacZ 的氨基端片斷的氨基端片斷 。 在在 lacZ 基因中有一段人工合成的含多基因中有一段人工合成的含多 種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，在此位點(diǎn)上插入外源種內(nèi)切酶的單一切點(diǎn)，在此位點(diǎn)上插入外源 DNA都能都能 滅活下游滅活下游 lacZ基因。基因。 用于基因克隆和測(cè)序用于基因克隆和測(cè)序 經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體經(jīng)典的大腸桿菌質(zhì)粒載體 pUC系列系列? 克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn) ：： 10個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于個(gè)連續(xù)的單一限制酶切位點(diǎn)，位于 lacZ’ 基因的基因的 5’端。端。? 選擇標(biāo)記選擇標(biāo)記 ：： Ampicillin 抗性和抗性和 lacZ 的的 ? 肽互補(bǔ)（藍(lán)肽互補(bǔ)（藍(lán) 白斑）相結(jié)合。白斑）相結(jié)合。5溴溴 4氯氯 3吲哚吲哚 βD半乳糖半乳糖異丙基異丙基 βD硫代半乳糖苷硫代半乳糖苷? 噬菌體（噬菌體（ Bacteriophage）） 噬菌體是一類(lèi)細(xì)菌病毒細(xì)菌病毒 ，能高效率高特異性地侵染宿主細(xì)胞，然后或自主復(fù)制繁殖，或整合入宿主基因組中潛伏起來(lái)，而且在一定的條件下上述兩種狀態(tài)還會(huì)相互轉(zhuǎn)化。 ? 結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著結(jié)構(gòu)：蛋白質(zhì)外殼內(nèi)包裹著 DNA（雙鏈、（雙鏈、單鏈、線性、環(huán)狀等）。單鏈、線性、環(huán)狀等）。2 噬菌體噬菌體 載體載體 噬菌體的一般特性噬菌體的一般特性T4 Bacteriophage 溶菌周期溶菌周期 —— —— 烈性噬菌體（烈性噬菌體（ virulent phage) 感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重感染細(xì)菌后立即在菌體內(nèi)復(fù)制和合成蛋白質(zhì)外殼，重新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量新組裝成噬菌體顆粒，并導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞解體，釋放出大量子代噬菌體。子代噬菌體。 溶原周期溶原周期 —— —— 溫和噬菌體（溫和噬菌體（ temperate phage) 感染細(xì)菌后，將自己的感染細(xì)菌后，將自己的 DNA整合到細(xì)菌的染色體整合到細(xì)菌的染色體 DNA中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（中。形成這一過(guò)程稱(chēng)為溶源化（ lysogenization)。原噬菌體（原噬菌體（ prophage)：： 整合到細(xì)菌染色體的噬菌體整合到細(xì)菌染色體的噬菌體 DNA稱(chēng)為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。稱(chēng)為原噬菌體，隨細(xì)菌的染色體復(fù)制而復(fù)制。 噬菌體的生活周期（有兩種）噬菌體的生活周期（有兩種）iii) 單鏈環(huán)狀單鏈環(huán)狀 DNA的絲狀大腸桿菌噬菌體：的絲狀大腸桿菌噬菌體： M1 f fd 噬菌體。噬菌體。M13 噬菌體噬菌體 單鏈?zhǔn)删w載體單鏈?zhǔn)删w載體 單鏈單鏈 DNA噬菌體的特點(diǎn)噬菌體的特點(diǎn)? +DNA（（ ssDNA）。）。? 復(fù)制型（復(fù)制型（ RF）是雙鏈環(huán)狀）是雙鏈環(huán)狀 DNA。? RF DNA和和 ssDNA都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生都能轉(zhuǎn)染感受態(tài)大腸桿菌，并產(chǎn)生 噬菌斑。噬菌斑。? 不存在包裝限制。不存在包裝限制。? 可產(chǎn)生大量的含有外源可產(chǎn)生大量的含有外源 DNA插入片斷的單鏈分子，便插入片斷的單鏈分子，便 于作探針或測(cè)序。于作探針或測(cè)序。 M13 噬菌體噬菌體寄主：大腸桿菌。 DNA長(zhǎng)度： 6407 bp。 外型 : 絲狀組成 : 由外殼包裝蛋白和正鏈 DNA組成基因 : 至少有 10個(gè)基因DNA提純：提純： RF dsDNA在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝在寄主細(xì)胞內(nèi)以高拷貝形式存在。形式存在。 成熟的噬菌體里只包裝有成熟的噬菌體里只包裝有 +DNA，也容易提取。也容易提取。M13 噬菌體不裂解宿主細(xì)胞，但抑制其生長(zhǎng)RF DNA:replicational form DNA優(yōu)點(diǎn)：? RFDNA(復(fù)制型 DNA)? +DNA轉(zhuǎn)譯與包裝相關(guān)的蛋白質(zhì)? RFDNA達(dá)到 200個(gè)拷貝時(shí) , +D
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