【文章內(nèi)容簡介】 OEt）： C2H5O 芐酯（ OBzl）： 叔丁酯（ OBut）： 羧基保護(hù)基 Z： 縮合劑： N， N′一二環(huán)己基碳二亞胺 （ N， N′dicyclohexyl carbodiimide， 縮寫 DCCI或 DCC） 脫去氨基保護(hù)基的方法： Boc用酸，如 50%三氟醋酸脫去 Tosyl用鈉氨還原法 脫去羧基保護(hù)基的方法： 芐酯（ OBzl） 用催化加氫法 叔丁酯（ OBut） 用酸，如 50%三氟醋酸脫去 Cbz用催化加氫法 甲酯或乙酯用皂化法 ② 將參與肽鍵合成的羧基和氨基活化 羧基的活化 : 氨基的活化： 接肽時(shí)加入有機(jī)堿如三乙胺或 KHCO3等，保證氨基處于自由狀態(tài)，氨基即活化。 早期用酰氯，但反應(yīng)太激烈，后來采用疊氮法，而現(xiàn)在用了最多的是 活化酯法 和 混合酸酐 法。 BOC BOC BOC BOC BOC Amino acid protected by tbutyloxycarboxyl (BOC) (b) 固相合成法 一、蛋白質(zhì)的分類 （一）根據(jù)蛋白質(zhì)分子的形狀 1． 球狀蛋白質(zhì) （ globular protein） 2．纖維狀蛋白質(zhì)（ fibrous protein） 第三節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能 （二）根據(jù)組成和溶解度 1．單純蛋白質(zhì)（ simple protein） : 也稱簡單蛋白質(zhì)，完全由氨基酸組 成的蛋白質(zhì)。 單純蛋白質(zhì)的分類（根據(jù)溶解度的不同） (1) 清蛋白 (albumin)： 溶于水及稀鹽、稀酸或稀堿溶液。如血清清蛋白。 (2) 球蛋白 (globulin)： 不溶于水而溶于稀鹽溶液，如血清球蛋白。 (3) 谷蛋白 (glutelin)： 不溶于水、醇及中性鹽溶液，但溶于稀酸、稀堿， 如米谷蛋白。 (4) 谷醇溶蛋白 (prolamine)： 不溶于水 ， 但溶于 70%~80%乙醇 ， 如玉米 醇溶蛋白 。 (5) 組蛋白 (histone)： 溶于水及稀酸溶液 ， 分子中含 Arg、 Lys 較多 ,呈 （ 弱 ） 堿性 ， 如小牛胸腺組蛋白 。 (6) 魚精蛋白 (protamine)： 溶于水及稀酸溶液 ， 分子中含堿性氨基酸特 別多 ， 呈 （ 強(qiáng) ） 堿性 ， 如鮭精蛋白 。 (7) 硬蛋白 (scleroprotein)： 不溶于水 、 鹽 、 稀酸 、 稀堿溶液 。 如膠原 蛋白 、 角蛋白 、 絲心蛋白 、 彈性蛋白等 。 2．結(jié)合蛋白質(zhì)（ conjugated protein）： 亦稱復(fù)合蛋白質(zhì)， 由蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)兩部分組成。 結(jié)合蛋白質(zhì)的分類（根據(jù)非蛋白質(zhì)即輔基的不同） (1) 糖蛋白（ glycoprotein）： 含糖類，如膠原蛋白。 (2) 脂蛋白（ lipoprotein）： 含脂類，如血漿脂蛋白。 (3) 核蛋白（ nucleoprotein）： 含核酸，如核糖體。 (4) 磷蛋白（ phosphoprotein）： 含磷酸，如酪蛋白。 (5) 金屬蛋白（ metalloprotein）： 含金屬，如鐵蛋白含 Fe。 (6) 血紅素蛋白（ hemoprotein）： 輔基為血紅素，如血紅蛋白。 (7) 黃素蛋白（ flavoprotein）： 輔基為黃素（ FAD或 FMN）， 如琥珀酸脫氫酶（含 FAD）。 （三）根據(jù)功能 1. 非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) 包括酶 、 激素蛋白 、 運(yùn)輸?shù)鞍?（ 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 ） 、 貯存蛋白 、 運(yùn)動蛋白 、 保護(hù)或防御蛋白 、 受體蛋白 、 控制生長和分化蛋白 、 毒蛋白 、膜蛋白等 。 2. 結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì) 對生物體起支持和保護(hù)作用，主要指硬蛋白包括膠原蛋白、角蛋白、絲蛋白、彈性蛋白等。 為了對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)敘述的方便，人為地將蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分為 一級結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)和四級結(jié)構(gòu) 。 蛋白質(zhì)的 一級結(jié)構(gòu) 又稱 初級結(jié)構(gòu) ， 二級結(jié)構(gòu)、三級結(jié)構(gòu)、四級結(jié)構(gòu) 的三度空間排列稱蛋白質(zhì)的 空間結(jié)構(gòu)、高級結(jié)構(gòu)、三維結(jié)構(gòu)或構(gòu)象。 二、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 隨著蛋白質(zhì)化學(xué)研究的進(jìn)展，認(rèn)為在二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)之間還可劃分 超二級結(jié)構(gòu) 和 結(jié)構(gòu)域 兩個(gè)層次，所以蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)層次為： 一級結(jié)構(gòu) 二級結(jié)構(gòu) 超二級結(jié)構(gòu) 結(jié)構(gòu)域 三級結(jié)構(gòu) 四級結(jié)構(gòu) （一）蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)（ primary structure） 1．定義： 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)是指蛋白質(zhì)多肽鏈中氨基酸的線性排列順序（ sequence） 。 氨基酸順序書寫時(shí) ， 從 N末端 (Nterminus) 至 C末端 (Cterminus). 肽鍵 (peptide bond)和二硫鍵 (disulfide bond) 均屬于蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu) . 2．蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的測定 序列測定前的準(zhǔn)備工作： 樣品的純度 相對分子質(zhì)量 肽鏈的數(shù)目 氨基酸組成 一級結(jié)構(gòu)的測定主要用 小片段重疊法 原理： Analysis of aa sequence in the polypeptide (protein sequencing) ? , insulin Nobel prize Major step: purification, disulfide bond break(single chain) 1. HCl degradation(6N, 110,180C,36h), aa position, aa seperation by ion exchange chromatography. 2. Nterminal(DNP, DansylCl), Cterminal (carboxylase) chemical method, enzymetic method 3. Peptide chain peptide fragment Enzyme. Trypsin (Lys. Arg), Chymotrypsin(Phe, Tyr, Trp), BrCN(Met) Seperation 4. Sequencing aa of peptide fragment Edman reation (degradation, phenlythisoctanate, 異硫氰酸苯脂） Aa sequencing 苯乙內(nèi)酰硫脲氨基酸 （ 1）肽鏈的拆開和分離與純化 共價(jià)鍵： 主要是二硫鍵折分 分離純化： 采用還原法或氧化法 序列測定步驟與方法 ? Dialysis (透析 ) ? Acetone precipitation and salt precipitation (沉淀 ) ? Electrophoresis (電泳 ) ? Chromatography (層析 ) ? Ultracentrifugation (超離心 ) （ 2）末端分析：包括 N端分析， C端分析 N端分析方法 ① 二硝基氟苯法（ DNP法、 DNFB法或 FDNB法） ② 丹磺酰氯法（ DNS法） ③ 苯異硫氰酸 (酯 )法（ PITC法、 PTC法、 PTH法、 Edman降解法 ） ④ 氨肽酶（ aminopeptidase, Apase） 法 Ala Val Gly 亮氨酸氨肽酶（ Leucine amino peptidase, LAP） 專一性 : A=非極性氨基酸時(shí) 快 A=其它氨基酸時(shí) 慢 A B N端 A=Leu時(shí) 最快 C端分析 ① 硼氫化鋰還原法 H N C H C O O HRL i B H 4H N C H C H 2 O HR水 解混 合 氨 基 酸 H 2 N C H C H 2 O HR+C 端② 肼解法：也稱聯(lián)氨法 ③ 羧肽酶（ carboxypeptidase, Cpase） 法 4種羧肽酶的來源和專一性 羧肽酶 來源 專一性 CpA 胰臟 能釋放除 pro、 Arg和 Lys以外的所有 C端氨基酸 CpB 胰臟 主要水解 C端為 Arg或 Lys的肽鍵 CpC 植物或微生物 相當(dāng)廣泛 ， 幾乎能釋放 C端的所有氨基酸 CpY 面包酵母 可釋放 C端所有氨基酸 （ 3）肽鏈的氨基酸組成分析 酸水解：通常用 6Mol/L HCl HPLC分析 Aa組成 （ 4）肽鏈的部分水解 化學(xué)方法： 溴化氰（ CNBr） 裂解法 : 酶解方法 Cleavage reagent (裂解劑 ) Cleavage site (裂解位點(diǎn) ) Trypsin (胰蛋白酶 ) Lys, Arg (C) Chymotrypsin (胰凝乳蛋白酶 ) Phe, Tyr, Trp (C) 彈性蛋白酶 Ala, Gly, Ser, Val (C) 胃蛋白酶 Phe, Trp, Tyr (N) Staphylococcus aureus Glu (C) Cyanogen bromide (溴化氰 ) Met (C) Hydroxylamine (羥胺 ) Asn— Gly （ 5）肽段的分離和氨基酸序列測定 ? Edman降解 （ 苯異硫氰酸酯法） 氨基酸順序分析法實(shí)際上也是一種 N端分析法。此法的特點(diǎn)是能夠不斷重復(fù)循環(huán)，將肽鏈 N端氨基酸殘基逐一進(jìn)行標(biāo)記和解離。 （ 6）找重疊肽從而推斷整個(gè)肽鏈的氨基酸序列 （ 7）二硫鍵位置的確定 對角線電泳 （ 8）酰胺基位置的確定 Aa position analysis Result: A 5, C 2, D 3, E 0, F 1, G 3, H 2, I 3, K 2, L 2, M 2, N 2, P 3, Q 1, R 1, S 2, T1, V 1, W 2, Y 0 Conclusion: Polypeptide has 38 Aa。 Trypsin will cleave at one R(Arg) and two K(Lys), to give four fragments. Cyannogen bromide will cleave at two M(Met) to give three fragments Treat with FDNB, hydrolyze, separate Aa 2,4dinitrophenylAsn detected N (Asn) is aminoterminal residues S S Cleave with cyanogen bromide, separate fragments C1: NGAAWHDFNPIDPRGASM C2: TKQCVHSD C3: ALIKWLIACGPM C3 overlap with T1 and T4, allowing them to be ordered Sequence on sequencer Sequence established NGAAWHDFNPFDPRGASMALIKWLIACGPMTKQCVHSD T2 T1 T4 T3 C1 C3 C2 (C) SS (b) HS SH T1: GASMALIK T2: NGAAWHDFNPIDPR T3: QCVHSD T4: WLIACGPMTK T2 placed at aminoterminus because it begins with N(Asn)。 T3 place at carbooxyl terminus because it does not end with R(Arg) or K(Lys). Cleave with trypsin,separate fragments Sequence on sequencer 3. 根據(jù) DNA序列推測蛋白質(zhì)氨基酸序列（ Deduction from DNA sequence） Isolate the genes encoding the protein DNA sequencing mRNA sequencing Dedermine the AA sequence according to the 3letter codons 4．蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫 (1) PIR（ Protein Information Resource） 數(shù)據(jù)庫 (2) SWISSPROT數(shù)據(jù)庫 （二）蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu) 一條多肽鏈中相鄰氨基酸殘基在空間上的有規(guī)則的 、 重復(fù)的排列－－蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu) 。(refers to regular, recurring arrangements in space of adjacent a