從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實驗方案說明(編輯修改稿)
2025-05-19 22:41 本頁面
【文章內(nèi)容簡介】 03的無菌水試管中，混勻后即為103土壤稀釋液，依次連續(xù)稀釋為10105土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中，用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。④涂布平板 用一支新的無菌槍頭，由低濃度開始，從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul，對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上，用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板（重復(fù)）。37℃下恒溫培養(yǎng)24h。復(fù)篩方法【1】劃線接種（分區(qū)劃線法）：在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進行分區(qū)劃線，先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3~4條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60176。角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線，再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線（如右圖）。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于28~29176。C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線23次，以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分，其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi)，用以保存菌種，另一部分用來做染色實驗。獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種：上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中，一個土樣取8個平板兩兩標記同一位置同序號標記，一平板分5個區(qū)域，點接重復(fù)兩次，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實驗室，其他置于無菌室。實驗室里，四個平板均加入碘液，立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置，并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號，利用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種，培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進行編號，然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡檢，若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體，則將其對應(yīng)的菌種劃線接種到新的營養(yǎng)瓊脂平板上，標記，37℃下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進行劃線分離，培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進行斜面接種。革蘭氏染色步驟：涂片、干燥及固定初染：在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液，染1分鐘，傾去染液，流水沖洗至無紫色。媒染：先用新配的路哥氏碘液沖去殘水，而后用其覆蓋涂面1分鐘，后水洗。脫色：除去殘水后，滴加95%酒精進行脫色約15－20秒，后立即用流水沖洗。復(fù)染：滴加番紅染色液，染3－5分鐘，水洗后用吸水紙吸干。 鏡檢：油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢：取37℃培養(yǎng)18～24h的枯草芽孢桿菌涂片，干燥，固定。于涂片上滴人3～5滴5%孔雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱，自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時，開始計算時間約4～5min。加熱過程中切勿使染料蒸干，必要時可添加少許染料。傾去染液，待玻片冷卻后，水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min，水洗。制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色，菌體紅色。（注：觀察芽孢的形狀和位置，查伯杰細菌手冊）貼標簽 取各種無菌斜面試管數(shù)支，將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上，貼在試管斜面的正上方，距試管口2～3
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