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正文內(nèi)容

從土壤中分離產(chǎn)淀粉酶的芽孢桿菌實驗方案說明(編輯修改稿)

2025-05-19 22:41 本頁面
 

【文章內(nèi)容簡介】 03的無菌水試管中,混勻后即為103土壤稀釋液,依次連續(xù)稀釋為10105土壤稀釋液。在土壤稀釋過程中,用相同的移液槍頭由濃到稀來稀釋。④涂布平板 用一支新的無菌槍頭,由低濃度開始,從各濃度土壤稀釋液中各吸取100ul,對號較均勻地放入已寫好稀釋度的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上,用灼燒冷卻后的無菌玻璃涂棒涂勻。每個濃度做3個平板(重復(fù))。37℃下恒溫培養(yǎng)24h。復(fù)篩方法【1】劃線接種(分區(qū)劃線法):在上述不同稀釋度培養(yǎng)基中挑取不同形態(tài)的單菌落進行分區(qū)劃線,先在平板培養(yǎng)基的一邊作第1次平行劃線3~4條,再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約60176。角,并將接種環(huán)上剩余物燒掉,待冷卻后通過第1次劃線部分作第2次平行劃線,再用同法通過第2次平行劃線部分作第3次平行劃線和通過第3次平行劃線部分作第4次平行劃線(如右圖)。劃線完畢,蓋上皿蓋,倒置于28~29176。C溫室中培養(yǎng)約20h.。再繼續(xù)分區(qū)劃線23次,以獲得較純的菌種。將純化得到的單菌落分為兩部分,其中一部分接種到培養(yǎng)基內(nèi),用以保存菌種,另一部分用來做染色實驗。獲得產(chǎn)淀粉酶芽孢桿菌純種:上述劃線接種后的菌落中各挑取形態(tài)特征不一致的點接于倒好的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基中,一個土樣取8個平板兩兩標記同一位置同序號標記,一平板分5個區(qū)域,點接重復(fù)兩次,在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。上述點接后的平板中取出一組四個分好區(qū)域的淀粉牛肉膏培養(yǎng)基平板于實驗室,其他置于無菌室。實驗室里,四個平板均加入碘液,立即觀察記錄陽性和陰性菌落所在位置,并可同時記錄透明圈的大小。根據(jù)所記錄的陽性菌的編號,利用另一組中的營養(yǎng)瓊脂平板上其對應(yīng)的菌落繼續(xù)劃線接種,培養(yǎng)后將出現(xiàn)的形態(tài)特征不一致的菌落進行編號,然后挑取部分出來進行革蘭氏染色鏡檢,若發(fā)現(xiàn)視野內(nèi)出現(xiàn)形態(tài)、大小、顏色一致且為桿菌的菌體,則將其對應(yīng)的菌種劃線接種到新的營養(yǎng)瓊脂平板上,標記,37℃下培養(yǎng)24h。否則繼續(xù)進行劃線分離,培養(yǎng)后再經(jīng)革蘭氏染色鏡檢直至得到純種桿菌后進行芽孢染色。篩選出芽孢純種后進行斜面接種。革蘭氏染色步驟:涂片、干燥及固定初染:在做好的涂面上滴加草酸銨結(jié)晶紫染液,染1分鐘,傾去染液,流水沖洗至無紫色。媒染:先用新配的路哥氏碘液沖去殘水,而后用其覆蓋涂面1分鐘,后水洗。脫色:除去殘水后,滴加95%酒精進行脫色約15-20秒,后立即用流水沖洗。復(fù)染:滴加番紅染色液,染3-5分鐘,水洗后用吸水紙吸干。 鏡檢:油鏡觀察染色結(jié)果。芽孢染色染色鏡檢:取37℃培養(yǎng)18~24h的枯草芽孢桿菌涂片,干燥,固定。于涂片上滴人3~5滴5%孔雀綠水溶液。用試管夾夾住載玻片在火焰上用微火加熱,自載玻片上出現(xiàn)蒸汽時,開始計算時間約4~5min。加熱過程中切勿使染料蒸干,必要時可添加少許染料。傾去染液,待玻片冷卻后,水沖洗至孔雀綠不再褪色為止。用石炭酸復(fù)紅液復(fù)染l min,水洗。制片干燥后用油鏡觀察。芽孢呈綠色,菌體紅色。(注:觀察芽孢的形狀和位置,查伯杰細菌手冊)貼標簽 取各種無菌斜面試管數(shù)支,將注有菌株名稱和接種日期的標簽貼上,貼在試管斜面的正上方,距試管口2~3
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