化工原理實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱(編輯修改稿)
2025-05-13 22:28 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 溫5min。，終止酶活動(dòng)，準(zhǔn)備測(cè)糖。（4）淀粉酶總活力測(cè)定取4支試管編號(hào)，2支為對(duì)照，2支為測(cè)定管。然后加入提取的酶液1ml。在對(duì)照管加入4ml 。以下步驟重復(fù)α淀粉酶測(cè)定第⑸步的操作，同樣準(zhǔn)備測(cè)糖。（5）樣品的測(cè)定： 取步驟2，3中酶作用后的各管溶液1ml，分別放入相應(yīng)的4支25ml具塞刻度試管中，各加入1ml 3，5—二硝基水楊酸試劑。以下操作同標(biāo)準(zhǔn)曲線制作。根據(jù)樣品比色吸光度，從標(biāo)準(zhǔn)曲線查出麥芽糖含量，最后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。教學(xué)方式學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成?？己艘笠猿銮?、隨堂提問、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和預(yù)習(xí)報(bào)告為主要考核內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列各項(xiàng)：（1）報(bào)告的題目（要簡(jiǎn)明確切）；（2）寫報(bào)告人及共同測(cè)定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；?）實(shí)驗(yàn)原理；（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7）實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，用公式計(jì)算。（8）分析與討論，要對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出估計(jì)，分析誤差大小及原因，對(duì)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進(jìn)行討論，對(duì)實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)備有何改進(jìn)建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。實(shí)驗(yàn)六 質(zhì)粒 DNA的提取本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求通過該實(shí)驗(yàn)使學(xué)生掌握質(zhì)粒培養(yǎng)的方法，條件（包括培養(yǎng)基的配制、滅菌、接種、培養(yǎng)）、以及提取質(zhì)粒的方法。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理從大腸桿菌中提取質(zhì)粒DNA的方法很多，其中的堿性SDS法提取質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異而予以分離的。在強(qiáng)堿性條件下，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均變性(雙鏈解開)。由于質(zhì)粒DNA是共價(jià)閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)，變性后兩條互補(bǔ)鏈不會(huì)完全分開。當(dāng)溶液pH調(diào)節(jié)到中性時(shí)，質(zhì)粒DNA容易復(fù)性并溶解在溶液中，而染色體DNA不容易復(fù)性，互相纏繞，在離心時(shí)極易和蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物等一起沉淀下來。轉(zhuǎn)移出上清液，再用乙醇沉淀出其中的質(zhì)粒DNA。 以具有質(zhì)粒pETblue2的大腸桿菌實(shí)驗(yàn)材料，用堿性SDS法可從該菌體中提取到質(zhì)粒DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳可以檢測(cè)出。需用的儀器和試劑高壓蒸汽滅菌鍋、超凈工作臺(tái)、恒溫振蕩搖床、臺(tái)式高速離心機(jī)、真空干燥器、低溫冰箱、恒溫水浴、移液器、LB培養(yǎng)基、羧芐青霉素（Carb）、四環(huán)素（tet）、TE 、溶液Ⅰ 、溶液Ⅱ 、溶液 Ⅲ、無水乙醇、70%乙醇實(shí)驗(yàn)步驟（1） 先在3mL LB液體培養(yǎng)基中加入3uL羧芐青霉素（Carb,終濃度50ug/mL）四環(huán)素（Tet,），然后接入一個(gè)含pETBlue－2質(zhì)粒的大腸桿菌單菌落，37℃ 190r/min振蕩培養(yǎng)過夜。（2） mL小指管管中，4000r/min離心1分鐘，吸去培養(yǎng)液將所有菌體細(xì)胞收集在一個(gè)小指管中。（3）加入100μL溶液I于含菌體細(xì)胞的小指管中，旋渦振蕩將細(xì)菌沉淀懸浮，室溫放置10分鐘。（4）加入200μL溶液II(新鮮配制)，輕輕混勻內(nèi)容物，將小指管置于冰上使菌液裂解變清（不可用旋渦震蕩器）。（5）加入150μL溶液III (冰上預(yù)冷),蓋緊管口，輕輕混勻數(shù)次。冰上放置15分鐘讓質(zhì)粒DNA復(fù)性（不可用旋渦震蕩器）。（6）12000 r/min離心10分鐘， mL小指管中。（7）向上清中加入等體積酚：氯仿：異戊醇 (去蛋白和脂類)，旋渦混勻，12000 r/min離心5分鐘， mL小指管中。（8）向上清中加入等體積氯仿：異戊醇(去微量酚和脂類)，旋渦混勻，12000 r/min離心5分鐘， mL小指管中。（9）向上清中加入2倍體積無水乙醇，旋渦混勻后，室溫放置30分鐘。12000 r/min 離心10分鐘，吸去上清液。（10）用1mL 75%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀兩次（每次12000 r/min 離心5分鐘），吸去上清液，真空抽干或空氣中干燥。（11）加20μL TE，使質(zhì)粒DNA完全溶解，－20℃保存。教學(xué)方式學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成?？己艘笠猿銮?、隨堂提問、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和預(yù)習(xí)報(bào)告為主要考核內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列各項(xiàng)：（1）報(bào)告的題目（要簡(jiǎn)明確切）；（2）寫報(bào)告人及共同測(cè)定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模唬?）實(shí)驗(yàn)原理；（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7）實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論（8）回答思考題。實(shí)驗(yàn)七 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求掌握電泳鑒定的基本操作技術(shù)，為從事基因工程和分子生物學(xué)研究奠定初步基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理瓊脂糖凝膠電泳適于分離鑒定200～20000bp的核酸片段。在中性pH條件下，核酸帶負(fù)電荷，在電場(chǎng)中向正極移動(dòng)，電泳后，核酸在凝膠中的位置通過“染色”來顯現(xiàn)。GoldView是一種可代替溴化乙錠的新型核酸染料，其靈敏度與EB相當(dāng)，使用方法與之完全相同，當(dāng)與DNA結(jié)合后，在紫外透射光下雙鏈DNA呈現(xiàn)黃色熒光，由于未發(fā)現(xiàn)GoldView有致癌作用，且靈敏度與EB相當(dāng)，將有可能逐漸取代EB而得以廣泛應(yīng)用。需用的儀器和試劑瓊脂糖、標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量DNA 、上樣緩沖液（6loading buffer）、TAE 、GoldView電泳儀、水平電泳槽、移液器實(shí)驗(yàn)步驟（1）將有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機(jī)
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