化工原理實(shí)驗(yàn)教學(xué)大綱-資料下載頁
2025-04-16 22:28本頁面
【正文】 ）寫報(bào)告人及共同測定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康?；?）實(shí)驗(yàn)原理；（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7）實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論。（8）回答思考題。實(shí)驗(yàn)九 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量本次實(shí)驗(yàn)的目的和要求學(xué)習(xí)和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理、方法、并應(yīng)用該方法測定蛋白質(zhì)分子量。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容或原理如果在聚丙烯酰胺凝膠中加入一定濃度的十二烷基硫酸鈉（SDS），由于SDS帶有大量的負(fù)電荷，且這種陰離子表面活性劑能使蛋白質(zhì)變性，特別是強(qiáng)還原劑如巰基乙醇存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)的二硫鍵被還原，肽鍵完全伸展，使蛋白質(zhì)分子與SDS充分結(jié)合，形成帶負(fù)電性的蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物；此時(shí)蛋白質(zhì)分子上所帶的負(fù)電荷量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過蛋白質(zhì)分子原有的電荷量，掩蓋了不同蛋白質(zhì)間所帶電荷的差異。蛋白質(zhì)分子量愈大，所帶的負(fù)電荷愈多，在電場中移動(dòng)得越快；反之越慢。 在聚丙烯酰胺凝膠電泳中，蛋白質(zhì)的遷移速率取決于它所帶的電荷的多少、分子的大小和形狀。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸鈉（SDS）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原， SDS，亞基的結(jié)構(gòu)呈長橢圓棒狀。由于與蛋白質(zhì)結(jié)合的SDS呈解離狀態(tài)，使蛋白質(zhì)亞基帶上大量負(fù)電荷，其數(shù)值大大超過蛋白質(zhì)原有的電荷量，掩蓋了不同亞基間原有的電荷差異。各種蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物具有相同的電荷密度，電泳時(shí)純粹按亞基大小靠凝膠的分子篩效應(yīng)進(jìn)行分離。有效遷移率與分子質(zhì)量的對數(shù)成很好的線性關(guān)系。所以，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅是一種好的蛋白質(zhì)分離方法，也是一種十分有用的測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法。應(yīng)該注意的是，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測得的是蛋白質(zhì)亞基的分子質(zhì)量。對寡聚蛋白來說，為了正確反應(yīng)其完整的分子結(jié)構(gòu)，還應(yīng)用連續(xù)密度剃度電泳或凝膠過濾等方法測定天然構(gòu)象狀態(tài)下的分子質(zhì)量及分子中肽鏈（亞基）的數(shù)目。需用的儀器和試劑恒壓電泳儀、垂直板電泳槽、注射器、加樣器、燒杯、下層膠緩沖液、上層膠緩沖液、Acr + Bis 貯備液、10% 過硫酸銨、樣品緩沖液（裂解液）、電極緩沖液、染色液、脫色液、%瓊脂、“低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白”、牛血清白蛋白、雞血清實(shí)驗(yàn)步驟（1）電泳槽的安裝：玻璃板先用洗液浸泡，再用熱水沖洗，再用蒸餾水沖洗，直立干燥，垂直地固定在兩半槽之間，對角擰緊。電泳槽裝好后，%的瓊脂注入背面槽內(nèi)的小池中。（2）樣品的處理：將標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)樣品及未知樣品分別配制濃度為2mg/ml的溶液，溶劑為SDS樣品處理液，溶解后在沸水浴中加熱34min。冷卻后待用。（3）制膠：將膠沿玻璃壁緩慢加入已準(zhǔn)備好的凝膠（在注膠過程中防止產(chǎn)生氣泡），膠加到玻璃頂3cm處，立即覆蓋35cm的水層，靜止聚合40min左右。膠聚合好的標(biāo)志是膠與水層之間形成清晰的界面。分離膠聚合好之后，吸去分離膠上的水層，注入濃縮膠，同時(shí)插入梳子 。其下端應(yīng)具分離膠面1cm，待膠聚合好后小心的取出梳子。（4）點(diǎn)樣：標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白：將標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白溶于SDS樣品緩沖液中（12mg/ml）在沸水浴中加熱34nin冷卻后使用。未知樣品：將提取的未知分子量蛋白用處理標(biāo)準(zhǔn)蛋白的方法處理之。在兩槽內(nèi)加入電極緩沖液，用微量進(jìn)樣器將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)混合物加入到一樣品槽內(nèi)，將未知樣品加入到其他樣品槽內(nèi)。（5）電泳：加樣接通電源后立即電泳（上槽接負(fù)極，下槽接正極），最初控制在15mA，當(dāng)樣品進(jìn)入分離膠以后 ，電流加大到30 mA，電壓恒定在80100V之間，當(dāng)指示劑染料溴酚藍(lán)到達(dá)距分離膠底部12cm時(shí)可停止電泳，電泳約需3～4小時(shí)。（6）固定和染色：電泳完畢，將膠取出，在水中浸泡10min，浸出部分SDS。后加入考馬斯亮藍(lán)R250，染色時(shí)間以染透整個(gè)凝膠板為準(zhǔn)，染料可重復(fù)使用。除去染色液后，用少量蒸餾水洗掉染料，然后加入脫色液，直至看出清晰的蛋白帶，去掉脫色液加入固定液。（7）脫色：用自來水沖洗凝膠上的染色液。之后放入脫色液中脫色。至能看出清晰的蛋白帶測量已知與未知蛋白質(zhì)的遷移率。（8）結(jié)果與計(jì)算：相對遷移率（Rm）= 蛋白質(zhì)的遷移距離（d2）/ 指示劑的遷移距離（d1）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線及測定未知蛋白分子量以標(biāo)準(zhǔn)蛋白的遷移率為橫坐標(biāo)，以其對應(yīng)的分子量的對數(shù)為縱坐標(biāo)。在半對數(shù)坐標(biāo)紙上作圖，可得一條線，然后根據(jù)未知樣品的遷移率在標(biāo)準(zhǔn)曲線上就可查得相應(yīng)的分子量，即為未知蛋白的分子量。教學(xué)方式學(xué)生為主，教師輔助，充分預(yù)習(xí)，獨(dú)立完成?？己艘笠猿銮凇㈦S堂提問、實(shí)驗(yàn)報(bào)告和預(yù)習(xí)報(bào)告為主要考核內(nèi)容。實(shí)驗(yàn)報(bào)告要求實(shí)驗(yàn)報(bào)告應(yīng)包括下列各項(xiàng)：（1）報(bào)告的題目（要簡明確切）；（2）寫報(bào)告人及共同測定人員的姓名；（3）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模唬?）實(shí)驗(yàn)原理；（5）實(shí)驗(yàn)儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7）實(shí)驗(yàn)結(jié)果。明確提出本次實(shí)驗(yàn)的結(jié)論，用公式計(jì)算。（8）分析與討論，要對實(shí)驗(yàn)結(jié)果做出估計(jì)，分析誤差大小及原因，對實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)的問題應(yīng)進(jìn)行討論，對實(shí)驗(yàn)方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)備有何改進(jìn)建議也可寫入此欄；（9）回答思考題。六、實(shí)驗(yàn)教材及主要參考資料劉祥云，張?jiān)瀑F ，李天俊主編，《生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》，2005年張龍翔等編著 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)方法和技術(shù)（第二版）北京大學(xué)出版社 13 / 1
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