化工原理實驗教學大綱(參考版)
2025-04-19 22:28本頁面
【正文】 六、實驗教材及主要參考資料劉祥云，張云貴 ，李天俊主編，《生物化學實驗指導》，2005年張龍翔等編著 生物化學實驗方法和技術(shù)（第二版）北京大學出版社 13 / 13。明確提出本次實驗的結(jié)論，用公式計算?？己艘笠猿銮凇㈦S堂提問、實驗報告和預習報告為主要考核內(nèi)容。在半對數(shù)坐標紙上作圖，可得一條線，然后根據(jù)未知樣品的遷移率在標準曲線上就可查得相應的分子量，即為未知蛋白的分子量。至能看出清晰的蛋白帶測量已知與未知蛋白質(zhì)的遷移率。（7）脫色：用自來水沖洗凝膠上的染色液。后加入考馬斯亮藍R250，染色時間以染透整個凝膠板為準，染料可重復使用。（5）電泳：加樣接通電源后立即電泳（上槽接負極，下槽接正極），最初控制在15mA，當樣品進入分離膠以后 ，電流加大到30 mA，電壓恒定在80100V之間，當指示劑染料溴酚藍到達距分離膠底部12cm時可停止電泳，電泳約需3～4小時。未知樣品：將提取的未知分子量蛋白用處理標準蛋白的方法處理之。其下端應具分離膠面1cm，待膠聚合好后小心的取出梳子。膠聚合好的標志是膠與水層之間形成清晰的界面。冷卻后待用。電泳槽裝好后，%的瓊脂注入背面槽內(nèi)的小池中。對寡聚蛋白來說，為了正確反應其完整的分子結(jié)構(gòu)，還應用連續(xù)密度剃度電泳或凝膠過濾等方法測定天然構(gòu)象狀態(tài)下的分子質(zhì)量及分子中肽鏈（亞基）的數(shù)目。所以，SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳不僅是一種好的蛋白質(zhì)分離方法，也是一種十分有用的測定蛋白質(zhì)分子質(zhì)量的方法。各種蛋白質(zhì)SDS復合物具有相同的電荷密度，電泳時純粹按亞基大小靠凝膠的分子篩效應進行分離。如果用還原劑（如巰基乙醇或二硫蘇糖醇等）和十二烷基硫酸鈉（SDS）加熱處理蛋白質(zhì)樣品，蛋白質(zhì)分子中的二硫鍵將被還原， SDS，亞基的結(jié)構(gòu)呈長橢圓棒狀。蛋白質(zhì)分子量愈大，所帶的負電荷愈多，在電場中移動得越快；反之越慢。實驗九 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法測定蛋白質(zhì)分子量本次實驗的目的和要求學習和掌握SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理、方法、并應用該方法測定蛋白質(zhì)分子量。明確提出本次實驗的結(jié)論?？己艘笠猿銮?、隨堂提問、實驗報告和預習報告為主要考核內(nèi)容。50μL PCR擴增產(chǎn)物＋6uL 10loadingbuffer ＋ 6uL SYBR核酸染料，混勻，全部上樣電泳，恒壓80V。（3）瓊脂糖凝膠電泳分析PCR結(jié)果。反應物含有：（1）模板：陽性對照（2）Taq酶：（3）引物1（4）引物2（5）dNTPs ( dATP 、dCTP、 dGTP 、dTTP）（6）電極緩沖液TAE： Tris乙酸（7）buffer緩沖液含有：2024個核苷酸，40%50%的鳥苷酸、胞苷酸，以及反應所需的MgCl2。所以選擇72℃作為延伸溫度足以支持30個循環(huán)。正是因為具有如此快速、簡便、經(jīng)濟、高效的特點，使得PCR技術(shù)成為分子生物學研究強有力的技術(shù)工具。Khorana等早在1971年就提出PCR概念，但直到1988年Saiki等從真細菌Thurmas aquticus rT1中開發(fā)出熱穩(wěn)定的TaqDNA聚合酶并實現(xiàn)PCR技術(shù)的完全自動化后，PCR才在生命科學研究領域被廣泛用來擴增DNA片段。明確提出本次實驗的結(jié)論；（8）回答思考題?？己艘笠猿銮凇㈦S堂提問、實驗報告和預習報告為主要考核內(nèi)容。（9）254nm紫外燈下觀察DNA條帶的完整性及亮度。DNA的遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過5V/cm。(記錄點樣順序及點樣量)。（6）加入電泳緩沖液（1TAE）至電泳槽中使緩沖液剛好沒過膠平面，輕輕取出梳子。（3），加入25mL 1TAE，用封瓶膜封住三角瓶的上口，在微波爐中將瓊脂糖溶化。需用的儀器和試劑瓊脂糖、標準分子質(zhì)量DNA 、上樣緩沖液（6loading buffer）、TAE 、GoldView電泳儀、水平電泳槽、移液器實驗步驟（1）將有機玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干，用橡皮膏將有機玻璃內(nèi)槽的兩端邊緣封好 (一定封嚴，不能留縫隙)。在中性pH條件下，核酸帶負電荷，在電場中向正極移動，電泳后，核酸在凝膠中的位置通過“染色”來顯現(xiàn)。實驗七 質(zhì)粒DNA的瓊脂糖凝膠電泳分析本次實驗的目的和要求掌握電泳鑒定的基本操作技術(shù)，為從事基因工程和分子生物學研究奠定初步基礎。實驗報告要求實驗報告應包括下列各項：（1）報告的題目（要簡明確切）；（2）寫報告人及共同測定人員的姓名；（3）實驗目的；（4）實驗原理；（5）實驗儀器和試劑（包括主要儀器的規(guī)格、主要試劑的名稱）；（6）實驗數(shù)據(jù)記錄（包括原始數(shù)據(jù)記錄表格和整理后的數(shù)據(jù)記錄表格）；（7）實驗結(jié)果。教學方式學生為主，教師輔助，充分預習，獨立完成。（10）用1mL 75%乙醇洗滌質(zhì)粒DNA沉淀兩次（每次12000 r/min 離心5分鐘），吸去上清液，真空抽干或空氣中干燥。（9）向上清中加入2倍體積無水乙醇，旋渦混勻后，室溫放置30分鐘。（7）向上清中加入等體積酚：氯仿：異戊醇 (去蛋白和脂類)，旋渦混勻，12000 r/min離心5分鐘， mL小指管中。冰上放置15分鐘讓質(zhì)粒DNA復性（不可用旋渦震蕩器）。（4）加入200μL溶液II(新鮮配制)，輕輕混勻內(nèi)容物，將小指管置于冰上使菌液裂解變清（不可用旋渦震蕩器）。（2） mL小指管管中，4000r/min離心1分鐘，吸去培養(yǎng)液將所有菌體細胞收集在一個小指管中
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