第七章親和層析(編輯修改稿)
2024-11-29 14:52 本頁(yè)面
【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 質(zhì)溶液 )混合，緩慢攪拌 (勿用磁力攪拌器 )2h(室溫 )或過(guò)夜 (4℃ )，以便 配體和基質(zhì) 充分偶聯(lián) 而 形成 固相載體 。 圖 74是 植物血球凝集素 (如 ConA)Sepharose4B親和吸附劑的制備流程 (供參考 )。 ? 3． 配體結(jié)合量的測(cè)定 配體結(jié)合量：一般是用每毫升或每克貯存膠束縛配體的量表示的 。 如用 mg／ m1表示 。 測(cè)得的配體結(jié)合量 ， 可 作為決定親和吸附劑實(shí)際用量的參數(shù) 。 ? 具體測(cè)定方法有兩種，即直接測(cè)定法和間接測(cè)定法。 ? (1)直接測(cè)定法 ① 2， 4， 6— 三硝基苯磺酸鈉的顏色試驗(yàn) ② 根據(jù)配體的特性進(jìn)行測(cè)定 ? (2)間接測(cè)定法 ① 推算法 一般情況下，從 加入配體的數(shù)量 中 減去 配體與活化瓊脂糖偶聯(lián)后 洗滌出來(lái)的配體量 ，即可大致推算出配體的結(jié)合量 。 ② 根據(jù)親和吸附劑對(duì)被吸附物質(zhì)的操作容量可計(jì)算配體的結(jié)合量 其方法有： 一是把親和吸附劑 裝入柱 ( 10cm)內(nèi)， 加入 過(guò)量的欲分離 大分子物質(zhì) ，使其結(jié)合量達(dá)到最大，用適當(dāng)?shù)南礈靹氐?洗去 非專一性的物質(zhì)，然后再用特異的 洗脫劑 洗出欲分離的大分子物質(zhì)。 根據(jù)分離出的大分子物質(zhì)的量，計(jì)算出配體的結(jié)合量。 二是把少量純品大分子物質(zhì)陸續(xù)加到親和層析柱中，直到飽和平衡為止，根據(jù)上樣量即可推算出配體的結(jié)合量。 四 、 特異性吸附 ? 大分子物質(zhì)在親和層析柱中的吸附過(guò)程 如圖 75所示 當(dāng)樣品開始加到已知具有一定配體濃度的親和層析柱 (A)時(shí) ， 欲分離的大分子物質(zhì)在柱中的濃度等于零； 當(dāng)樣品開始進(jìn)入柱中時(shí) ， 配體和欲分離的大分子物質(zhì)間相互接觸 ， 并 形成 復(fù)合物 ， 但也 有部分 復(fù)合物分解 ； 當(dāng) 樣品不斷地通過(guò)柱子時(shí) ， 欲分離的大分子物質(zhì)與配體之間形成的復(fù)合物 濃度越來(lái)越大 。 也就是說(shuō) ， 隨著樣品不斷地通過(guò)柱子 ， 欲分離的大分子物質(zhì)的濃度會(huì)恒定地增加 (B)。 由于配體的存在使欲分離 大分子物質(zhì)的移動(dòng)受到 阻礙 ， 從而導(dǎo)致產(chǎn)生緊密的 復(fù)合物帶 (C)。 ? 樣品中 有效成分 在親和吸附劑上的 吸附量 ， 與它們之間的 親和力 有密切關(guān)系 ， 還與樣品的 pH值 和 離子強(qiáng)度 有關(guān)系 。 五 、 分離大分子物質(zhì) （ 洗脫 ） ? 除去雜質(zhì) 樣品過(guò)柱后 ， 可用大量的 平衡液 即起始緩沖液 洗去 無(wú)親和力的 雜蛋白 ， 有時(shí)也可用 不同的緩沖液 洗滌去除之； 最后留在柱上的只有專一吸附的大分子物質(zhì) 。 ? 洗脫有效成分 將柱上專一吸附的大分子物質(zhì)洗脫下來(lái)。 洗脫液要能使復(fù)合物完全分離，其具體作法可根據(jù)親和力決定： ? ① 親和力 比較小時(shí) ， 可以連續(xù)用大體積 平衡緩沖液洗脫 ， 得到遲緩的大分子物質(zhì)峰 。 ? ② 親和力 一般時(shí) ， 主要靠 改變緩沖液的性質(zhì) (如改變pH值或離子強(qiáng)度 ， 或者同時(shí)改變 pH值和離子強(qiáng)度 )，使復(fù)合物之間的 親和力下降 到足以分離的程度 。 ? ③ 親和力 較強(qiáng)時(shí) ， 可用 與配體競(jìng)爭(zhēng)的溶液 或者用 蛋白質(zhì) 變性劑 洗脫 。 A． 競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑 這類洗脫劑的優(yōu)點(diǎn)是專一性強(qiáng) ， 并能洗脫出和配體特異結(jié)合的大分子物質(zhì) 。 B． 劇烈的洗脫條件 (蛋白質(zhì)變性劑 ) 如用鹽酸胍 、 尿素等變性試劑配制的溶液洗脫下的蛋白質(zhì)等生命大分子物質(zhì)；需要經(jīng)過(guò)適當(dāng)?shù)奶幚矸娇苫謴?fù)活性 。 六 、 親和層析柱的再生 ? 當(dāng)洗脫結(jié)束后 ， 應(yīng)連續(xù)用大量的 洗脫液 或 高濃度的 鹽溶液 徹底洗滌柱子 ， 接著再用 平衡緩沖液 使層析柱 重新平衡 。 ? 經(jīng)過(guò)這樣處理的柱子可再次上樣 ， 進(jìn)行第二次親和層析 。 ? 一般親和層析柱都可以反復(fù)使用多次 。 第
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