【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 劃線法。在本實(shí)驗(yàn)中仍要學(xué)習(xí)這兩種方法。一、目的要求 掌握幾種常用的分離純化物的基本操作技術(shù)。二、基本原理從混雜的微生物群體中獲得只含有某一種或某一株微生物的過程稱為微生物的分離與純化。平板分離法：該方法操作簡(jiǎn)便，普遍用于微生物的分離與純化，其包括兩個(gè)方面：鋇嵐縣緱虜榮產(chǎn)濤團(tuán)藺締崳惲囂驁瘋。．選擇適合于待分離微生物的生長(zhǎng)條件等要求或者加入某種抑制劑造成只利于該微生物生長(zhǎng)，而抑制其它微生物生長(zhǎng)的環(huán)境，從而淘汰一些不需要的微生物；懨俠劑鈍觸樂鷴燼觶騮揚(yáng)銥鯊臘騖韋。 ．微生物在固體培養(yǎng)基生長(zhǎng)形成的單個(gè)菌落可以是一個(gè)細(xì)胞繁殖而成的集合體，因此可通過挑取單菌落而獲得一種純培養(yǎng)。獲得單個(gè)菌落的方法可通過稀釋涂布平板或平板劃線等計(jì)數(shù)來完成的。謾飽兗爭(zhēng)詣繚鮐癩別瀘鯽礎(chǔ)輪駭騷獅。純培養(yǎng)的確定：．確定其菌落觀察特征；．結(jié)合顯微鏡檢測(cè)個(gè)體形態(tài)特征的確定。三、實(shí)驗(yàn)器材．無菌培養(yǎng)皿(直徑90mm)、無菌吸管、無菌錐形瓶、無菌試管、管無菌水(每管有滅菌過的自來水)。咼鉉們歟謙鴣餃競(jìng)蕩賺趲為練濺騙閻。．營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(已滅菌的) 、水樣或活性污泥。．接種環(huán)、酒精好(或煤氣燈)、恒溫箱(培養(yǎng)箱)等。以上器材，除水樣或活性污泥、接種環(huán)、恒溫箱外，均在實(shí)驗(yàn)五中準(zhǔn)備好。四、操作方法及步驟(一)活性污泥的純種分離與培養(yǎng)．稀釋平板分離()取樣()稀釋水樣)將支裝有無菌水的試管以、（或－、－、－、－、－）依次編號(hào)?，撝C齷蘄賞組靄縐嚴(yán)減籩諏戀鄰驂灝。)以無菌操作，用的無菌吸管吸取樣品于第一管無菌水中，將吸管吸洗次，搖勻，即為稀釋倍的菌液。再從此濃度的菌液中吸取于第二管中，將吸管吸洗次，搖勻，即為稀釋倍的菌液，以同樣方法，依次類推，分別得到稀釋倍、倍及倍的菌液，所得菌液分別為、及(即－、－、－、－及－)等濃度。麩肅鵬鏇轎騍鐐縛縟糶爾攤鱘嫗騅鐳。()平板的制作)將無菌培養(yǎng)皿編號(hào)為、……(－、－、…－)。)另取一支的無菌吸管從濃度小的－的菌液開始，依次分別取菌液于相應(yīng)編號(hào)的培養(yǎng)皿內(nèi)(每個(gè)濃度做個(gè)平板)。每次吸取時(shí)，吸管都應(yīng)在菌液中反復(fù)吸洗幾次。納疇鰻吶鄖禎銣膩鰲錟顫階躦萵騍潤(rùn)。)在稀釋菌液的同時(shí)，就要將營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基加熱融化，待融化的培養(yǎng)基冷到一176。左右(溫度不可過高，否則微生物容易被燙死，溫度過低，培養(yǎng)基容易凝固，平板不平)時(shí)，傾注一入上述盛有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)(每一培養(yǎng)皿內(nèi)應(yīng)加入的培養(yǎng)基量須根據(jù)皿的大小決定，以能使培養(yǎng)皿底部鋪滿培養(yǎng)基而形成厚約—3mm的薄層為適當(dāng)，在直徑為90mm的培養(yǎng)皿內(nèi)注入—，可滿足此要求)，如圖—所示。在傾注前，應(yīng)先將盛有培養(yǎng)基的管子的管口或瓶子的瓶口在火焰上微燒一周。培養(yǎng)基傾入后迅速蓋上皿蓋，培養(yǎng)基傾入后平放桌上，輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使培養(yǎng)基和稀釋菌液充分混合均勻，冷卻后，即成平板。將培養(yǎng)皿倒置于176。的恒溫箱中培養(yǎng)，觀察有無菌落長(zhǎng)出。培養(yǎng)皿所以要倒置是為了防止培養(yǎng)基內(nèi)水分蒸發(fā)到皿蓋上而使培養(yǎng)基變干。風(fēng)攆鮪貓鐵頻鈣薊糾廟誑繃紙鯉騏鍔。．平板劃線分離。()取樣 同前。()制備平板培養(yǎng)基 將融化的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基以無菌操作倒入無菌的空培養(yǎng)皿內(nèi)(操作方法同前，但培養(yǎng)皿內(nèi)末注入菌液)。加蓋，在平桌上轉(zhuǎn)動(dòng)，凝固后即成所需的平板。滅噯駭諗鋅獵輛覯餿藹猙廚憮犧駿灃。()劃線 以無菌操作，右手持經(jīng)燒灼滅菌冷卻的接種環(huán)從裝有活性污泥的器皿中取一環(huán)活性污泥。同時(shí)左手持培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀起一些，右手把接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿，將一環(huán)活性污泥在平板表面輕輕地劃線(千萬不要戳破培養(yǎng)基平板)，可作平行劃線、扇形劃線，或其它連續(xù)劃線。無論采用那種方法，其目的都是通過劃線將樣品在平板上進(jìn)行稀釋，使之形成單個(gè)菌落。劃線后，將皿蓋蓋好。倒置培養(yǎng)皿于176。恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，則平板上即長(zhǎng)出菌落。接種環(huán)用過后即再燒灼滅菌。鐒鸝餉飾鐔閌貲諢癱騮吶轉(zhuǎn)鮭錢驗(yàn)鎖。(二)其它一些接種的操作技術(shù)微生物的接種方法，除前面所提到的外，隨著所用的培養(yǎng)基、實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡鹊牟煌?，還有好幾種，但是它們的基本操作都是類似的，并且都要嚴(yán)格注意無菌操作。攙閿頻嶸陣澇諗譴隴瀘鐙澮蹤島騁檻。．斜面接種技術(shù) 這是將微生物從一個(gè)斜面培養(yǎng)基(或平板培養(yǎng)基)上接種到另一個(gè)斜面培養(yǎng)基上的方法，見圖—。斜面培養(yǎng)基可用小試管(15mm150mm)制備，每管約裝一(／一／試管高度)，見圖－。趕輾雛紈顆鋝討躍滿賺蜆騍純蠅驪銬。()將試管貼上標(biāo)簽、注明菌名、接種日期等。()將培養(yǎng)好的菌種和斜面培養(yǎng)基的兩支試管用大拇指和其它指握在左手中，使中指位于兩試管之間的部分。斜面向上，管口齊平，并使它們位于水平位置。夾覡閭輇駁檔驀遷錟減汆藥徑鴕駭槍。()將棉塞用右手?jǐn)Q轉(zhuǎn)松動(dòng)，以利接種時(shí)拔出。()右手拿接種環(huán)，在火焰上將環(huán)燒灼滅菌，環(huán)上凡是在接種時(shí)可能進(jìn)入試管的部分都應(yīng)用火燒灼。()在火焰旁，用右手拔掉棉塞。()以火焰微燒試管口一周，燒灼時(shí)應(yīng)不斷地轉(zhuǎn)動(dòng)管口，使管口上可能沾污的少量菌或帶菌塵埃得以燒去。()將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先將環(huán)接觸沒有長(zhǎng)菌的培養(yǎng)基部分(如斜面的頂端)，使其冷卻，以免燙死被接種的菌種。然后輕輕挑取少許菌種，抽出接種環(huán)并迅速將接種環(huán)伸進(jìn)另一試管，在培養(yǎng)基上輕輕劃線(由底部向頂部劃線)。視絀鏝鴯鱭鐘腦鈞欖糲僉爾魷癆駱鈐。()接種完后，將接種環(huán)取出，將試管塞好棉塞。．液體接種 這是由斜面培養(yǎng)基(或平板培養(yǎng)基)接種到液體培養(yǎng)基中的方法。()操作方法與前同，試管可略向上斜，以免培養(yǎng)基流出。()將取有菌種的接種環(huán)送入液體培養(yǎng)基時(shí)，可使環(huán)在液體表面與管壁接觸的部分輕輕摩擦，接種后，塞上棉塞。將試管在手掌內(nèi)輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使菌體在培養(yǎng)基中均勻分散。偽澀錕攢鴛擋緬鐒鈞錠鈴鉍蹌鏟驊擷。．由液體培養(yǎng)基接種液體培養(yǎng)基 接種用具常用無菌吸管或無菌滴管。無菌操作注意事項(xiàng)與前同，吸管或滴管要預(yù)先經(jīng)干熱或濕熱法滅菌，不能在火焰上燒灼。具體操作較簡(jiǎn)單，只要用無菌吸管或滴管從有菌的試管吸取一定量的培養(yǎng)液到另一管液體培養(yǎng)基中，塞好棉塞即可。緦徑銚膾齲轎級(jí)鏜撟廟耬癬紇徑驕鄰。．穿刺接種 這是由斜面菌種接種到固體深層培養(yǎng)基的方法。培養(yǎng)基可裝于大試管(20mm220mm)內(nèi)，每管約裝—。騅憑鈳銘僥張礫陣軫藹攬齊彎議罵擰。()如前斜面接種操作，但用接種針(必須很挺直)取出少許菌種。()用左手斜握盛有固體深層培養(yǎng)基的試管，用右手將接種針移入培養(yǎng)基，自中心刺入，直到接近管底，但不要穿透。然后沿穿刺途徑緩慢將針拔出。這樣，接種線整齊，易于觀察。癘騏鏨農(nóng)剎貯獄顥幗騮鴣詼驤齔駘輸。將以上分離、接種的培養(yǎng)物置于恒溫箱中在一定溫度下培養(yǎng)一定時(shí)間后觀察結(jié)果。接種環(huán)和接種針用畢后均應(yīng)再燒灼滅菌。微生物的分離、培養(yǎng)、接種等操作，前已述及，最好在經(jīng)紫外線滅菌的無菌室內(nèi)或無菌箱內(nèi)進(jìn)行，要嚴(yán)格注意無菌操作。在沒有無菌室或無菌箱的情況下，實(shí)驗(yàn)精度又要求不高時(shí)，則可在一般的實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，但必須特別注意無菌操作。鏃鋝過潤(rùn)啟婭澗駱讕瀘載撻贏禱驛懼。五、思考題用一根無菌吸管取幾種濃度的水樣時(shí)，應(yīng)從哪一個(gè)濃度開始?為什么?實(shí)驗(yàn)八 純培養(yǎng)菌種的菌體、菌落形態(tài)觀察本實(shí)驗(yàn)是將實(shí)驗(yàn)七中分離出來的幾種微生物為材料，進(jìn)行菌體形態(tài)、菌落形態(tài)特征的觀察。并通過革蘭氏染色，以了解活性污泥中大體由哪些類群的微生物所組成。榿貳軻謄壟該檻鯔塏賽緯闥糝鍔駕躦。一、實(shí)驗(yàn)器材．顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、酒精燈。．革蘭氏染色液全套。．實(shí)驗(yàn)七培養(yǎng)出來的各種菌種。二、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容和方法．接種斜面培養(yǎng)基 將已經(jīng)分離培養(yǎng)出來的幾種不同形態(tài)特征的菌落在無菌操作條件下，用接種環(huán)分別挑取少許菌種接種到各個(gè)斜面培養(yǎng)基上，塞好棉塞，放在試管架上，置于℃恒溫箱中培養(yǎng)后，進(jìn)行觀察。邁蔦賺陘賓唄擷鷦訟湊幟結(jié)廢擴(kuò)駑彎。．菌落形態(tài)特征的觀察 由于微生物個(gè)體的表面結(jié)構(gòu)、分裂方式、運(yùn)動(dòng)能力、生理特性以及產(chǎn)生色素的能力等各不相同，因而個(gè)體在固體培養(yǎng)基上的情況各有特點(diǎn)。按照微生物在固體培養(yǎng)基上形成的菌落的特征，可粗略地辨別是何種類型的微生物。應(yīng)注意菌落的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、大小、菌落高度、顏色、透明度、氣味及粘滯性等。一般來說，細(xì)菌和酵母菌的菌落比較光滑濕潤(rùn)，用接種環(huán)容易將菌體挑起。放線菌的菌落硬度較大，干燥致密，且與基質(zhì)緊密結(jié)合，不易被針或環(huán)挑起。霉菌菌落常長(zhǎng)成絨狀或棉絮狀。嶁硤貪塒廩袞憫倉華糲饃勵(lì)騮詡駐賭。如果要鑒定菌種，則對(duì)微生物在斜面培養(yǎng)基上及液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的特征都應(yīng)比較詳細(xì)地觀察。在斜面培養(yǎng)基上觀察菌落生長(zhǎng)旺盛程度、形狀、顏色及光澤等。在液體培養(yǎng)基中則觀察渾濁度、有無沉淀、液體表面生膜與否、膜的形狀等。在穿刺接種時(shí)則觀察菌落在基質(zhì)表面的情況、菌落的延伸情況以及是否液化培養(yǎng)基和液化的情況等。觀察時(shí)繪出菌落形態(tài)特征圖。該櫟諼碼戇沖巋鳧薩錠謨贛贅眾騶嶠。本實(shí)驗(yàn)只學(xué)習(xí)觀察一般微生物菌落形態(tài)待征，不作菌種鑒定。所以，只做瓊脂平板和瓊脂斜面的觀察，并同時(shí)結(jié)合微生物個(gè)體形態(tài)觀察，以達(dá)到了解和熟悉幾種微生物的菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)持征。劇妝諢貰攖蘋塒呂侖廟痙湯籪糶駒責(zé)。．微生物個(gè)體形態(tài)觀察 在觀察了已培養(yǎng)好的各種微生物菌落形態(tài)以后，用革蘭氏染色法染色，進(jìn)行顯微鏡油鏡的觀察，并繪制形態(tài)圖。臠龍訛驄椏業(yè)變墊羅蘄囂馱廣閏駙孫。三、記錄、菌落形態(tài)特征的觀察菌落序號(hào)形態(tài)邊緣菌落直徑菌落高度顏色透明度氣味粘滯性、微生物個(gè)體形態(tài)觀察序 號(hào)玻片名稱放大倍數(shù)形態(tài)草圖三、思考題你從樣品中分離出幾種微生物?其菌落形態(tài)和個(gè)體形態(tài)是怎樣的?革蘭氏染色呈什么反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)九 微生物的生理生化特性微生物的代謝與呼吸，主要依賴于酶的活動(dòng)。各種微生物具有不同的酶類，因此，它們對(duì)某些含碳化合物及含氮化合物的分解利用情況不同，代謝產(chǎn)物也有所不同。所以，我們可以利用各種微生物生理生化反應(yīng)的特點(diǎn)來作為鑒別它們的一種依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)以大腸菌群為例子。鰻順褸悅漚縫囅屜鴨騫鬩藶騍擯駟謔。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康脑谒幚砉こ讨?，水源水要?jīng)過處理后才能供給用戶。飲用水要求清澈、無色、無臭，更重要的是沒有病原菌。因此，自來水在出廠以前要作水質(zhì)的物理化學(xué)分析和細(xì)菌檢驗(yàn)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)合給水凈化工程中的細(xì)菌檢驗(yàn)，作細(xì)菌總數(shù)和大腸菌群的測(cè)定。通過大腸菌群的測(cè)定，了解大腸桿菌的生理生化特性。穡釓虛綹滟鰻絲懷紓濼視嬌賭謗駔墮。大腸菌群數(shù)系指每升水樣中所含有的大腸菌群的數(shù)目。大腸菌數(shù)一般包括大腸埃希氏桿菌、產(chǎn)氣桿菌、枸椽酸鹽桿菌和副大腸桿菌。本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵試驗(yàn)采用含有乳糖的培養(yǎng)基，故測(cè)定結(jié)果不包括副大腸桿菌。隸誆熒鑒獫綱鴣攣駘賽澇鈧籜軍驢該。細(xì)菌總數(shù)是指水樣在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，于176。經(jīng)培養(yǎng)后，所生長(zhǎng)的細(xì)菌菌落的總數(shù)(實(shí)際上所表示的是腐生細(xì)菌的數(shù)目。腐生細(xì)菌在營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上所形成的菌落呈白色細(xì)點(diǎn)狀)。浹繢膩叢著駕驃構(gòu)碭湊農(nóng)瑤帳結(jié)駁噴。我國(guó)現(xiàn)行生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)—規(guī)定：細(xì)菌總數(shù)是指水中不得超過個(gè)，大腸菌群水中不得超過個(gè)。鈀燭罰櫝箋礱颼畢韞糲銨鵬駱隸驅(qū)訛。二、實(shí)驗(yàn)用具．水樣瓶 任何具有玻璃塞、質(zhì)量良好的玻璃瓶都可用。．吸管、試管、錐形瓶等。．稀釋瓶 稀釋水樣所用的玻璃瓶最好為瘦長(zhǎng)形，并具有嚴(yán)密的玻璃塞，其容量要比實(shí)際用的水量大二倍，有時(shí)可在普通試管上加塞，作為稀釋管。瓶口或管端須以紙或紗布包好扎緊。愜執(zhí)緝蘿紳頎陽灣熗鍵艤訥贓棧馴嘆。．培養(yǎng)皿(平皿) —般采用直徑90mm，高15mm的。．發(fā)酵管和發(fā)酵瓶(圖—) 發(fā)酵管有大小之別，小發(fā)酵管可用15mm150mm的試管，大發(fā)酵管和發(fā)酵瓶須有以上的容量。管和瓶?jī)?nèi)都須裝倒置的小試管(直徑一般—10mm、長(zhǎng)一40mm，小發(fā)酵管取用較小的小試管，大發(fā)酵管和發(fā)酵瓶取用較大的小試管)，這種小試管常稱為倒管，用以聚集氣體。貞廈給鏌綞牽鎮(zhèn)獵鎦龐朮戧籩賂馱見。．接種環(huán)。．細(xì)菌濾器。．濾膜。．高壓蒸汽滅菌器。．恒溫箱(培養(yǎng)箱)。．電冰箱。．顯微鏡。．鏡油(香柏油)、二甲苯、擦鏡紙等。．普通放大鏡 能放大五倍以上。．電位計(jì)(或氫離子濃度比色計(jì)或精密試紙)。以上是一些主要的實(shí)驗(yàn)用具。測(cè)定細(xì)菌總數(shù)時(shí)需要、、等用具；發(fā)酵法檢驗(yàn)大腸菌群時(shí)需要、、、等用具；濾膜法檢驗(yàn)大腸菌群則基本上需要上述全部用具。嚌鯖級(jí)廚脹鑲